6 仪器和设备

6.1 高效液相色谱串联四级杆质谱仪或相当者：配有电喷雾离子源。

6.2 分析天平：感量0.1 mg, 0.01 g。

6.3 旋转蒸发器。

6.4 固相萃取装置。

6.5 旋涡混合器。

6.6 高速冷冻离心机，10000r/min。

6.7 移液枪，10 uL～100 uL,100 uL～1000uL。

6.8 pH计。

6.9 螺旋盖聚丙烯离心试管，50 mL。

6.10 组织捣碎机。

6.11 均质器。

6.12 超声波仪。

6.13 吹氮浓缩仪。

6.14 恒温水浴。

6.15 振荡器。

7 测定步骤

7. 1样品提取

称取试样3g(精确到0.01g)，置于50 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，依次加入100 uL混合氘代内标中间液，加入5 mL乙酸铵缓冲液(5.9)，在均质器中均质30 s，加入60uL、β-葡糖苷硫酸酯酶(5.8),混匀30 s，于40℃恒温水浴中振摇过夜，然后放冷至室温，加入乙腈20 mL，于涡旋混合器上混合5 min，超声提取10 min，然后10000r/min，-10℃高速冷冻离心5 min，收集上清液于另一个干净的50 mL具螺旋盖离心管中，加入20 mL正己烷-二氯甲烷溶液(5.10)，振摇5 min，静置后，溶液分成上中下三层，吸取中间层(乙腈＋二氯甲烷)溶液于梨形蒸发瓶中，剩余溶液再用10 mL乙腈重复上述提取步骤，合并中间层(乙腈＋二氯甲烷)溶液于梨形蒸发瓶中，40℃减压浓缩至于，加入0.5 mL乙腈，5 mL水，混匀，待净化。

7.2 固相萃取净化

将C₁₈固相萃取柱(5.11)安装在固相萃取装置上，依次以5 mL甲醇和5 mL水进行活化，将样品提取液转移至C18萃取柱中，控制流速约每秒1滴。依次用5mL 10％甲醇水溶液和5 mL水淋洗柱子，淋洗液完全通过小柱后，加压至干，用6 mL甲醇洗脱，洗脱液收集到梨形蒸发瓶中，在40℃真空旋转蒸发至近干，再用氮气流吹干，加入0.5mL乙腈溶解残渣，涡旋混合1 min，加0.5 mL水，混匀，过0.22 um滤膜，供液相色谱/串联质谱仪测定。

7.3 测定

7.3.1 液相色谱条件

a)色谱柱：Kromasil 60-5CN, 5 um, 250 mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙腈＋水(70+30);

c)流速：600 uL/min;

d)柱温：35℃；

e)进样量：20uL。

7.3.2 质谱条件

a)离子化模式：电喷雾；

b)扫描极性：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

d)分辨率：单位分辨率。

7.3.3 高效液相色谱-质谱/质谱测定

根据试样中被测孕激素类药物残留的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。标准工作液和待测液中九种孕激素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下各种孕激素类药物的参考保留时间为17a-羟孕酮的6.2 min,烯丙孕素6.3 min，炔诺孕酮 6.4min，炔诺酮6.8 min，美仑孕酮6. 8 min，甲地孕酮6. 8 min，孕酮6.8 min，甲轻孕酮6.9min,氯地孕酮7.2 min。

相关链接：进出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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