3.4 标准品

叶酸标准品(C₁₉H₁₉N₇O₆):纯度≥99%。

3.5 标准溶液的配制

3.5.1 叶酸标准储备液(20.0μg/mL):精确称取20.0mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解并转移至1000mL容量瓶中，定容至刻度。

叶酸标准储备液浓度标定:准确吸取1.0mL标准储备液至5mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液定容至刻度。用紫外-可见分光光度计,于比色杯厚度1cm,波长256nm条件下，以氢氧化钠乙醇溶液调零点，测定3次标准溶液吸光度值,取平均值按式(1)计算叶酸标准储备液浓度。

式中：

C₁—标准储备液中叶酸浓度,单位为微克每毫升(ug/mL);

A—平均吸光度值；

E—摩尔消光系数,数值为24500；

M—叶酸相对分子质量,数值为441.42；

5——稀释倍数；

1000—由克每升换算为微克每毫升的换算系数。

标定好的叶酸标准储备液储存于棕色瓶中，于2℃～4℃冰箱可保存两年。

3.5.2 叶酸标准中间液(0.200μg/mL):准确吸取1.00mL叶酸标准储备液置于100mL棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度,混匀后储存于瓶中2℃～4℃冰箱可保存1年。

3.5.3 叶酸标准工作液(0.200ng/mL):准确吸取1.00mL叶酸标准中间液置于1000mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。现用现配。

4 仪器和设备

4.1 天平：感量为0.1mg和1mg。

4.2 恒温培养箱：37℃±100℃。

4.3 压力蒸汽消毒器：121℃(0.10MPa~0.12MPa)。

4.4 涡旋振荡器。

4.5 离心机：转速≥3000r/min。

4.6 接种环。

4.7 PH计：精度为±0.1。

4.8 紫外-可见分光光度计。

4.9 超净工作台。

4.10 超声波振荡器。

5 菌种的制备与保存

5.1 菌种

鼠李糖乳杆菌LactobaciIluscaseispp.rhamnosus(ATCC 7469)。

5.2 储备菌种的制备

将菌种鼠李糖乳杆菌转接至琼脂培养基中，在37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h,连续传种2代～3代。取出后放入2℃～4℃冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代1次,可传30代。

实验前将储备菌株接种至琼脂培养基中，在37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h以活化菌株,用于接种液的制备。

注：保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代～3代以保证细菌活力。

5.3 接种液的制备

试验前一天,取2mL叶酸标准工作液与4mL叶酸测定用培养液混匀，分装至2支5mL离心管中，塞上棉塞，于121℃(0.10MPa～0.12MPa)高压灭菌15min后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中，于37℃±1℃恒温培养箱中培养20h～24h。取出后将种子培养液混悬,无菌操作下用无菌注射器吸取0.5mL转种至另两支已消毒但不含叶酸的培养液中，于37℃±1℃再培养6h。振荡混匀，制成接种液,立即使用。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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