6.5 灭菌

将所有测定系列管塞好棉塞，于121℃(0.10MPa～0.12MPa)高压灭菌15min。

6.6 接种和培养

待测定系列管冷却至室温后,在无菌操作条件下,用预先高压灭菌的移液管向每支测定管加接种液20uL,混匀。塞好棉塞,置于37℃±1℃恒温培养箱中培养20h～40h,直至获得最大混浊度，即再培养2h透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准0管(含0.00ng叶酸)不接种作为0对照管。

6.7 测定

将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1cm比色杯，于540nm处，以未接种0对照管调节透光率为100%(或吸光度值为0),依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管有明显的细菌增长;或与0对照管相比,标准0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.1以上)，或标准系列管透光率最大变化量＜40%(或吸光度值最大变化量＜0.4),说明可能有杂菌或不明来源叶酸混入,需重做实验。注：叶酸测定适宜的光谱范围540nm～610nm。

6.8 分析结果表述

6.8.1 标准曲线：以标准系列管叶酸含量为横坐标,每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标,绘制标准曲线。

6.8.2 试样结果计算:从标准曲线查得试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量(5),如果3支试样系列管中有2支叶酸含量在0.10ng～0.80ng范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10%,则可继续按式(2)、式(3)、式(4)进行结果计算,否则需重新取样测定。试样稀释液叶酸浓度按式(2)计算：

式中：

c—试样稀释液中叶酸浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL)；

c_x—从标准曲线上查得试样系列管中叶酸含量,单位为纳克(ng)；

V_x—制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积,单位为毫升(mL)。采用直接提取法的试样叶酸含量按式(3)计算：

式中:X——试样中叶酸含量,单位为微克每百克(μg/100g);

C—试样稀释液叶酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(ng/mL)

V—试样提取液定容体积,单位为毫升(mL)；

f—试样提取液稀释倍数；

m—试样质量,单位为克(g);
由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(ug/100g)的系数。

采用酶解提取法的试样叶酸含量按式(4)计算：

式中：

X—试样中叶酸含量,单位为微克每百克(ug/100g);

c—试样稀释液中叶酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(ng/mL)；

f—试样提取液稀释倍数；

c₀—酶空白液中叶酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V—试样提取液定容体积,单位为毫升(mL)；

m—试样质量,单位为克(g);
由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(ug/100g)的系数。

注1：液体试样叶酸含量也可以微克每百毫升(ug/100mL)为单位。

注2：叶酸测定也可采用预包埋菌种的叶酸测定用试剂盒(微生物法)，测定过程应参照试剂盒说明书,效果相当。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

7 精密度

一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

8 其他

果蔬类试样称样量为5g时,检出限为0.2ug/100g,定量限为0.4ug/100g;蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时,检出限为1.0ug/100g,定量限为2.0ug/100g;营养强化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为0.5ug/100g,定量限为1.0ug/100g。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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