5.4.3 生物样品分析方法的建立和确证

5.4.3.1 由于生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液、器官或组织等,具有取样量少、受试物浓度低、干扰物质多以及个体差异大等特点，因此必须根据受试物的结构、生物介质和预期的浓度范围，建立灵敏、特异、精确、可靠的生物样品定量分析方法,并对方法进行确证。

5.4.3.2 生物样品分析方法有：

a)色谱法:气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱-质谱联用法(LC-MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS),生物样品分析一般首选色谱法；

b)免疫学方法:放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等；

c)微生物学方法；

d)同位素示踪法。

对方法进行确证一般应进行以下几方面的考察：

a)特异性:必须证明待测物是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要分析6个不同个体空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图及给予受试物后的生物样品色谱图。

b)标准曲线与定量范围:根据待测物的浓度与响应的相关性,用回归分析方法(如用加权最小二乘法)获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

c)精密度与准确度：要求选择3个不同浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度的考察。低浓度选择在定量下限附近,其浓度在定量下限的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。

d)定量下限:定量下限是标准曲线上的最低浓度点,要求至少能满足测定3个～5个消除半衰期时样品中的受试物浓度，或峰浓度的1/10～1/20时的受试物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，批内和批间相对标准差应小于20%。

e)样品稳定性:根据具体情况,对含受试物的生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。

f)提取回收率:应考察高、中、低3个浓度的提取回收率,其结果应精密和可重现。

5.4.4 观察指标

5.4.4.1 血中受试物浓度-时间曲线

5.4.4.1.1 受试动物数

动物给予受试物后选择9个～11个不同的时间点采血,每个时间点的动物数不应少于5只。最好从同一动物个体多次取样。如由多只动物的数据共同构成一条血中受试物浓度-时间曲线,应相应增加动物数，以反映个体差异对试验结果的影响。

5.4.4.1.2 采样点

给予受试物前需要采血作为空白样品。为获得给予受试物后的一个完整的血中受试物浓度-时间曲线,采样时间点的设计应兼顾受试物的吸收相、分布相(峰浓度附近)和消除相。整个采样时间至少应/持续到3个～5个消除半衰期，或持续到血中受试物浓度为峰浓度的1/10～1/20。

5.4.4.1.3 毒物动力学参数

根据试验中测得的各受试动物的血中受试物浓度-时间数据，求得受试物的主要毒物动力学参数。静脉注射给予受试物,应提供消除半衰期、表观分布容积、曲线下面积、机体总清除率等参数值;血管外给予受试物，除提供上述参数外，尚应提供峰浓度和峰时间等参数，以反映受试物吸收的规律。

5.4.4.1.4 单次给予受试物

单次给予不同剂量的受试物(或其放射性同位素标记物)后，于不同时间测定血浆或全血中受试物浓度(或总放射活性强度)，提供各个受试动物的血中受试物浓度-时间数据和曲线及其平均值、标准差及其曲线;各个受试动物的主要毒物动力学参数及平均值、标准差。

5.4.4.1.5 重复多次给予受试物

重复多次给予受试物,应结合单次试验进行,一般选取一个剂量多次给予受试物，至少提供3次稳态的受试物的谷浓度,达稳态后进行末次给予受试物试验。于不同时间测定血浆或全血中受试物浓度或总放射活性强度，与单次给予受试物相比,确定重复多次给予受试物时的毒物动力学特征。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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