4.2.1.7分析条件的选择

(1)提取净化条件的选择

1)样品提取液的选择

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考易溶于乙酸乙酯、乙腈。试验表明，采用碱化乙酸乙酯可提高甲砜霉素回收率，使上述三个化合物回收率都符合要求，对于氟苯尼考胺，碱性条件下，使其呈游离态，更易被有机溶剂提取。试验表明用碱化乙酸乙酯提取，达到满意的提取效率。因此本实验选用碱化乙酸乙酯作为提取溶剂。分别用乙酸乙酯-25%氨水(100+1)、乙酸乙酯-25%氨水(100+2)和乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯作为提取液，在同-添加水平，相同实验条件下，四者均能达到满意的回收率。但乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯的回收率实验更稳定。因此在本方法中选择含有乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯作为提取液。

2)净化条件的选择

样品的乙酸乙酯萃取液中含有类脂物，需净化。通过实验以水-正己烷液液分配除脂，效果明显且回收率高。

3)残渣溶解度实验

样品的乙酸乙酯萃取液浓缩后，残渣用水溶解。分别用1mL、2mL、3mL水溶解残渣，结果表明1mL、2mL、3mL水溶解残渣，氯霉素和氟苯尼考的回收率无明显差异，回收理想。而以1mL水溶解残渣，甲砜霉素、氟苯尼考胺的回收率稍低，因此采用2mL水溶解残渣，且超声5min。

(2)仪器条件的优化

1)质谱条件的优化

蠕动泵以10μL/min的流速连续注射0.1mg/L的氣霉素类和氟苯尼考胺标准溶液入TurbolonSpray电离源中，氯霉素类结构上有氯原子，在负离子检测模式的灵敏度高，而氟苯尼考胺结构中不含有氯原子，在正离子检测模式的灵敏度高。分别在负离子检测模式下对三种氯霉素类和在正离子检测模式下对氟苯尼考胺进行一-级质谱分析(Q1扫描)，在得到分子离子峰，对各准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，氯霉素类二级质谱见图4-6。由此确定定性用的各离子对。

图4-6 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的子离子全扫描色谱图

采用MRM模式采集数据，选择驻留时间为200ms，优化各离子对的去簇电压(DP)，碰撞气能量(CE)，聚焦电压(FP)，入口电压(EP)，碰撞池出口电压(CXP)。

2)色谱条件的优化

采用“T”三通方式，即蠕动泵以10μL/min的流速连续注射0.1mg/L的氯霉素类标准溶液，流动相则以300uL/min的流速与氯霉素类标准溶液混合后进入离子源来进行优化。当分别用0.1%甲酸、0.1%乙酸、1mmol/L醋酸铵溶液代替流动相组成中的水，未发现氯霉素类和氟苯尼考胺灵敏度的明显变化。有报道指出在负离子模式下用乙腈代替流动相中的甲醇会增强信号强度。实验以乙腈-水作为流动相，未观察到氯霉素类灵敏度的显著提高。本方法以甲醇-水作为流动相，灵敏度已足以满足要求。对于氯霉素类检测，经比较多家品牌的色谱柱，结果表明在普通C₁₈的2.1mm内径的色谱柱都可满足，采用了DiscoveryC₁₈柱。氟苯尼考胺在普通的C₁₈不易保留，出峰时间太快，所以考虑采用C₈柱，实验表明其在C₈柱上有较好的保留，本方法采用Intersil C8-3柱分析氟苯尼考胺。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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