富营养化（eutrophication)是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从贫营养状态过渡到富营养状态，沉积物不断增多，逐渐变为沼泽，最后演变为陆地。这种自然过程非常缓慢，常需几千年甚至上万年，而人为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化现象，可以在短期内出现。水体富营养化后，即使切断外界营养物质的来源，也很难自净和恢复到正常水平。局部海区可变成“死海”，或出现“赤潮”现象。

许多参数可作为水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素a含量和初级生产率的大小。

一、实验目的

1．掌握总磷、叶绿素a及初级生产率的测定原理及方法。

2．评价水体的富营养化状况。

二、仪器和试剂

1．仪器

(1)可见分光光度计。

(2）移液管1mL，2mL,，10mL。

(3）容量瓶100mL,250mL。

(4）锥形瓶250mL。

(5）比色管25mL。

(6)BOD瓶250mL。

(7）具塞小试管10mL。

(8）玻璃纤维滤膜、剪刀、玻璃棒、夹子。

(9)多功能水质检测仪。

2．试剂

(1)过硫酸按（固体）。

(2）浓硫酸。

(3)硫酸溶液lmol/L。

(4）盐酸溶液2mol/L。

(5)氢氧化钠溶液6mol/L。

(6)1%酚酞1g酚酞溶于90mL乙醇中，加水至100mL。

(7）丙酮液丙酮，水＝9:10

(8）酒石酸锑钾溶液将4.4gK(SbO)C4H4O6•½H2O溶200mL蒸馏水中，用棕色瓶在4℃时保存。

(9)铝酸按溶液将20g（NH4）₆Mo7O₂₄·4H20 溶于500mL蒸馏水中，用塑料瓶在4℃时保存。

(10）抗坏血酸溶液（(0.1mol/L)溶解l.76g抗坏血酸于100mL蒸馏水中，转入棕色瓶。若在4℃以下保存，可维持1个星期不变。

(11)混合试剂50mL 2mol/L硫酸、5mL酒石酸锑钾溶液、15mL钥酸按溶液和30mL抗坏血酸溶液。混合前，先让上述溶液达到室温，并按上述顺序混合。在加人酒石酸锑钾或铂酸按后，如混合试剂有浑浊，必须摇动混合试剂，并放置几分钟，至澄清为止。若在4℃下保存，可维持1个星期不变。

(12)磷酸盐储备液（1.00mg/mL磷）称取1.0988KH2PO4,溶解后转入250mL容量瓶中，稀释至刻度，即得1.00mg/mL磷溶液。

(13）磷酸盐标准溶液量取1.00mL储备液于100mL容量瓶中，稀释至刻度，即得磷含量为10ug/mL的标准溶液。

三、实验过程

（一）磷的测定

1．实验原理

在酸性溶液中，将各种形态的磷转化成磷酸根离子（PO43-)。随之用钥酸按和酒石酸锑钾与之反应，生成磷钥锑杂多酸，再用抗坏血酸把它还原为深色钥蓝。

砷酸盐与磷酸盐一样也能生成钥蓝，0.1ug/mL的砷就会干扰测定。六价铬、二价铜和亚硝酸盐能氧化铝蓝，使测定结果偏低。

2．实验步骤

(1)水样处理水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌2~3min，以至混合均匀。量取100mL水样（或经稀释的水样）两份，分别放入两只250mL锥形瓶中，另取100mL蒸馏水于250mL锥形瓶中作为对照，分别加入1mL2mol/LH2SO4,3g(NH4)2S2O8，微沸约lh，补加蒸馏水使体积为25-50mL（如锥形瓶壁上有白色凝聚物，须用蒸馏水将其冲入溶液中），再加热数分钟。冷却后，加1滴酚酞，并用6mol/LNaOH将溶液中和至微红色。再滴入2mol/LHCl使粉红色恰好褪去，转入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，移取25mL至50mL比色管中，加1mL混合试剂，摇匀后放置10min，加水稀释至刻度，再摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，用lcm比色皿，于波长880nm处测定吸光度（若分光光度计不能测定880nm处的吸光度，可选择710nm波长）。

(2）标准曲线的绘制．分别吸取10ug/mL磷的标准溶液0.00、0.50mL、1.00mL,1.50mL,2.00mL,2.50mL,3.00mL于50mL比色管中，加水稀释至约25mL，加入1mL混合试剂，摇匀后放置10min，加水稀释至刻度，再摇匀，l0min后，以试剂空白作参比，用lcm比色皿，于波长880nm（或710nm）处测定吸光度。根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。

3．结果处理

由标准曲线查得磷的含量，按下式计算水中磷的含量：

Ρp=Wp/V

式中Ρp——水中磷的含量，mg/L；

WP——由标准曲线上查得磷的含量，ug；

V——测定时吸取水样的体积（本实验V=25.00mL)。

（二）生产率的测定

1．实验原理

绿色植物的生产率是光合作用的结果，与氧的产生量成比例。因此，测定水体中的氧可看作对生产率的测量。然而植物在任何水体中都有呼吸作用产生，要消耗一部分氧。因此在计算生产率时，还必须测量因呼吸作用所损失的氧。本实验采用测定两只无色瓶和两只深色瓶中相同样品内溶解氧变化量的方法测定生产率。此外，测定无色瓶中氧的减少量，提供校正呼吸作用的数据。

2．实验步骤

(1）取样取4只BOD瓶，其中2只用铝箱包裹使之不透光，分别记作“亮”和“暗”瓶。从一水体上半部的中间取出水样，测量水温和溶解氧。本实验中溶解氧采用多功能水质检测仪测定。如果此水体的溶解氧未过饱和，则记录此值为ρoi，然后将水样分别注入一对“亮”和“暗”的瓶中。若水样中溶解氧过饱和，则缓缓地给水样通气，以除去过剩的氧。重新测定溶解氧并记作Poi。按上法将水样分别注入一对“亮”和“暗”的瓶中。

从水体下半部的中间取出水样，按上述方法同样处理。将两对“亮”和“暗”瓶分别悬挂在与取样相同的水深位置，调整这些瓶子，使阳光能充分照射。一般将瓶子暴露几个小时，暴露期为清晨至中午，或中午至黄昏，也可为清晨到黄昏。为方便起见，可选择较短的时间。

(2)测定暴露期结束即取出瓶子，逐一测定溶解氧，分别将“亮”和“暗”瓶的数值记为Poi和Pod。

3．结果处理

(1）呼吸作用氧在暗瓶中的减少量：

R=Poi一Pod

①净光合作用氧在亮瓶中的增加量：

Pn=Po1一Poi

②总光合作用Pg=呼吸作用十净光合作用，即：

Pg=（Poi-Pod)+(Po1-Poi)=Po1－Pod

(2)计算水体上下两部分值的平均值。

(3)通过以下公式的计算来判断每单位水域总光合作用和净光合作用的日生产率。

①把暴露时间修改为日周期：

Pg’[mgO2/(L·d)]＝Pg×每日光周期时间／暴露时间

②将氧生产率单位从mg/L改为mg/m2，这表示lm“水面下水柱的总产生率。为此必须知道产生区的水深：

Pg''[mgO2/(m2·d)]=Pg×每日光周期时间／暴露时间×10³×水深（m)10³是体积浓度mg/L换算为mg/m3的系数。

③假设全日24h呼吸作用保持不变，计算日呼吸作用：

R[mg02/(m²·d)]=R×24／暴露时间（h)×103×水深（m)

④计算日净光合作用：

Pm[mgO2/(L·d)］=Pg－R(8-9)

(4)假设符合光合作用的理想方程(CO2+H20→CH2O+O2)，将生产率的单位转换成固定碳的单位：

Pm[mgC/(m²·d)]＝Pn[mgO2/(m²·d)]×12/32

（三）叶绿素a的测定

1．实验原理

通过测定水体中的叶绿素a的含量，可估计该水体的绿色植物的存在量。将色素用丙酮萃取，测量其吸光度值，便可以测得叶绿素a的含量。

2．实验过程

①将100~500mL水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。将滤纸卷成香烟状，放人小瓶或离心管中。加l0mL或足以使滤纸淹没的90％丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4℃下暗处放置4h。如有浑浊，可离心萃取液。将一些萃取液倒入lcm玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长为665nm和750nm处测其吸光度。

②加1滴2mo1/L盐酸于上述两只比色皿中，混匀并放置Imin，再在波长为665nm和750nm处测定吸光度。

3．结果处理

酸化前：A=A665一A750

酸化后：Aa=A665a－A750a

在665nm一处测得吸光度减去750nm处测得值是为了校正浑浊液。

用下式计算叶绿素a的浓度（ug/L)

叶绿素a={29(A－Aa)V萃取液}/V样品

式中V萃取液——萃取液体积，mL；

V样品——样品体积，mL。

根据测定结果，并查阅有关资料，评价水体富营养化状况。