一、前言

食用合成色素已列入GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》。目前，食品中合成色素的检测方法(GB/T5009.35-2003)是:先将样品中合成色素用聚酰胺粉吸附，然后在碱性条件下解吸附，再用液相色谱法进行分离后与标准品比较定性、定量。本方法利用SPE小柱选择分离性强的特点，通过小柱吸附色素，然后去掉干扰物，解析定容后采用液相色谱定性、定量。本法较之于国标法，前处理简单快速，回收率高。

二、试剂

1.甲醇:色谱纯

2.氨水:分析纯

3.氨化甲醇溶液(2%):准确量取2mL氨水和98mL甲醇混匀备用。

4.乙酸铵(0.02mol/L):称取1.54g乙酸铵，加水溶解，定容至1000mL，经0.45μm过滤器过滤。

5.石油醚:沸程为60℃～90℃。

6.固相萃取柱:StrataX-AW60mg/3mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化并保持湿润。

7.合成色素标准溶液

(1)胭脂红:1000μg/mL；苋菜红:1000μg/mL；柠檬黄:1000μg/mL；日落黄:1000μg/mL；亮蓝:1000μg/mL，以上均由中国计量科学研究院化学所研制。

(2)诱惑红标准物质为固体粉末，称量0.1000g，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。此浓度为1000μg/mL。

(3)标准储备液:临用前吸取上述色素溶液各10mL至100mL容量瓶,再用水定容，此为使用液，各色素浓度均为100μg/mL。

三、仪器

1.高效液相色谱仪:Agilent1100(配有紫外检测器)。

2.电子天平:感量为0.1mg。

3.高速离心机:4000r/min。

4.匀浆机。

5.超声波清洗器。

6.氮吹仪。

7.固相萃取装置。

8.漩涡混合器。

四、操作方法

1.样品处理

(1)饮料类样品:吸取10.0mL样品于25mL比色管中，含二氧化碳的样品需超声振荡驱除二氧化碳。

(2)配制酒类样品:吸取10.0mL样品于25mL比色管中，水浴加热驱除乙醇。

(3)硬糖、淀粉软糖、蜜饯类样品:称取5.0g粉碎的样品于25mL比色管中，加10mL水，60℃水浴温热溶解，过滤备用。

(4)其他固体样品

①香肠、午餐肉等肉制品:称取5.0g粉碎均匀的样品于25mL比色管中(如脂肪含量较高，需加10mL石油醚萃取除去脂肪)，加10mL水，匀浆、超声提取10min，离心后过滤，收集滤液。

②糕点类及一般固体样品:称取5.0g粉碎均匀的样品于25mL比色管中(如脂肪含量较高，需加10mL石油醚萃取除去脂肪)，加10mL水，漩涡震荡2min，超声提取10min，离心后过滤，收集滤液。

2.净化

将上述滤液，置于80℃水浴中浓缩至约2mL，然后将处理后所得的溶液全部转移至固相萃取柱中，依次用3mL甲醇、3mL水洗涤，弃去全部流出液，抽至近干时，用5mL氨化甲醇溶液洗脱。注意:整个过程控制流速不超过1mL/min。将洗脱溶液置于氮吹仪上，用50℃氮气吹干，再用1mL水溶解，漩涡混合1min，经0.45μm过滤器过滤后备用。

3.高效液相色谱测定

(1)色谱条件

①色谱柱:ZORBAX SB-C18 5μm4.6×250mm

②流动相:甲醇-乙酸铵溶液(0.02mol/L)。

③梯度洗脱:梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

④进样量:20μL。

⑤柱温:23℃，波长254nm。

(2)测定

6种合成着色剂标准品的液相色谱图如图1所示

图1 6种着色剂标准样品色谱图

(3)根据保留时间定性，外表峰面积定量，计算:

X=(C×V×1000)/(m×1000)

式中:X——样品中色素的含量，mg/kg；C——测定用样液中色素的含量，μg/mL；m——样品质量，g；V——样品定容后总体积，mL。

五、样品的线性范围、检出限、回收率以及精密度

将标准储备液稀释成(单位:μg/mL)0.100、0.200、0.400、1.00、3.00、5.00的标准系列，经0.45μm过滤器过滤后，在液相上进行定量分析得出回归方程和线性范围并计算出检出限，如表2所示。

表2 回归方程、线性范围及检出限

选择果味饮料、蜜饯、火腿肠、烤蛋糕4种不同样品，添加5.0mg/kg标准样品，扣除空白后计算出回收率。同时选取蜜饯，连续测定5次，计算出精密度，具体结果如表3、表4所示。

表3 不同产品添加相应着色剂的回收率

同一样品添加后连续测定5次的精密度

六、结果讨论

1.本方法在前处理方面与国标检验方法比较:因为采用SPE小柱对着色剂进行了有效的吸附分离，所以前处理所需的时间和步骤均明显优于国标，节省了大量的人力和物力。

2.本方法回收率方面与国标检验方法比较:本方法着色剂回收率基本控制在91%～98%之间，回收率较高，精密度均小于5%。而国标聚酰胺粉吸附法回收率基本在80%～90%之间，所以本方法在回收率方面优于国标法。

3.目前，国标(GB/T5009.141-2003)诱惑红检测采用的纸色谱法，前处理为聚酰胺粉吸附，检出限为25mg/kg，本方法在前处理和检出限方面都明显优于国标。

原子荧光标准溶液的配制是一个稀释的过程，即将购买的高浓度的标准溶液按要求、比例稀释到所需浓度，使之成为一个浓度序列，检定测得的原子荧光值呈线性关系。所以，溶液配制得好坏将直接影响到检定结果的准确性。因为砷、锑的测定条件基本相同，所以此两种元素可以同时测定。因此，JJG939-2009《原子荧光光度计》检定规程要求配制的是两种元素的混合标准溶液。JJG939-2009中所提供的检定用试剂和溶液配制方法比较简单，下面就原子荧光光度计检定用标准溶液的配制、保存及注意事项进行总结讨论。

一、原子荧光光度计检定所需试剂及其性质

1.盐酸:优级纯(GR)

浓盐酸为无色或微黄色易挥发液体，有刺激性气味。能与水混溶，溶于碱液。对其的操作应在通风橱中进行。

2.硼氢化钾(硼氢化纳)

纯度不低于95%。白色至灰白色细结晶粉末或块状，吸湿性强，因此需与干燥剂一起存放。能溶于水、液氨，不溶于乙醚、苯、烃类，性质稳定，还原性强，其溶液在此主要作为还原剂使用。因为硼氢化钾溶液见光易分解，其溶液需用棕色瓶避光保存。

3.氢氧化钾(氢氧化钠)

分析纯(AR)是用来保护硼氢化钾的。常温下是一种白色晶体，具有吸水性、强腐蚀性；易溶于水，同时放出大量热。

4.硫脲:分析纯(AR)

白色光亮苦味晶体，能溶于冷水、乙醇，微溶于乙醚，20℃时在水中的溶解度为137g/L。有毒性，接触皮肤会吸收，因此配制溶液时应避免与皮肤接触。

5.二次去离子水

指去离子水经过亚沸蒸馏得到的水，一般用在物化或分析试验中。其中，用离子交换法制备的水被称为去离子水，去离子水不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰离子、pH值为中性的水(干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的)。去离子水不同于蒸馏水，蒸馏法只能除去水中非挥发性的物质，并不能除去溶解在水中的气体，蒸馏水纯度一般不如去离子水，去离子水比蒸馏水电导率更小。通常情况下，普通定量分析蒸馏水就可以，仪器用水一般根据结果量级选择用水，最低标准是去离子水，这里因为结果量级比较高，因此使用的是二次去离子水。

6.标准溶液

砷标准原液(GBW08611，1000μg/mL，U=1μg/mL，k=2，中国计量科学研究院)、锑(GBW(E)080545，100μg/mL，U=1%，k=2)。

二、原子荧光光度计检定用试剂配制所需设备

1.天平:最大秤量为200g或500g，分度值不大于0.1g。

2.玻璃量具(A级):100mL、200mL、1000mL容量瓶数个；100mL、500mL烧杯数个；1mL、5mL、10mL、20mL移液管或吸量管数个；玻璃棒。

3.其他实验用器具。

三、原子荧光光度计检定用试剂配制、保存及注意事项

1.原子荧光光度计检定用试剂的作用原理

JJG939-2009规定要配制的是砷、锑混合标准溶液。测定砷和锑的关键是将As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)还原为氢化物。As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)与硼氢化钾反应的时间较长，As(Ⅲ)、Sb(Ⅲ)更容易形成氢化物。前处理应将五价砷、锑先还原为三价，因此需要加入硫脲和抗坏血酸进行预还原。JJG939-2009规定，配制标准溶液时需加入100g/L的硫脲水溶液，未提到抗坏血酸，是因为抗坏血酸的作用是使溶液更加稳定并促进还原，硫脲的作用是还原和对Cu2+、Co3+、Ni2+等离子起掩蔽作用，硫脲和抗坏血酸在一起还原效果更好。按照JJG939-2009的要求，配制的标准溶液需要现用现配，则抗坏血酸的添加与否基本无影响。

进行分析时，在酸性环境条件下同时加入硼氢化钾溶液，发生以下反应:

NaBH4+3H2O+HCl→H3BO3+NaCl+8H→EHn+H2 (过量)

(2+n)H+Em+→EHn+H2

E为可形成氢化物元素(砷、锑)，m可以等于或不等于n。

形成的氢化物被原子化后，受光源光能所激发发生跃迁到较高能级，并在回到较低能级的同时辐射出原子荧光。

需要注意的是，硼氢化钾是强还原剂，在中性和酸性的情况下易分解，与水或空气中的氧气和二氧化碳反应，见光易分解。在溶液中加入氢氧化钾可使其较稳定地存在，保持低温可减缓它的分解。同时，氢氧化钾容易与玻璃中的硅发生反应生成硅酸钠，因此配好的溶液要用塑料瓶子进行保存，以保持溶液的有效浓度。如现用现配，在玻璃器皿中影响不大。

2.原子荧光光度计检定用试剂的配制

(1)100g/L的硫脲溶液的配制

以配制100mL的溶液为例。在分析天平上称量10g硫脲(白色晶状固体，放在小烧杯中用差重法称量)，用少量二次去离子水溶解，玻璃棒轻轻搅动，如溶解不完全可适当水浴加热，但不可温度过高。用玻璃棒将溶解的硫脲溶液移入100mL的容量瓶中定容。硫脲溶液配制中，可加入抗坏血酸，亦可不加。

(2)100ng/mL的砷、锑标准储存液的配制

逐级稀释法，可以降低误差，提高准确性。所以在稀释砷、锑标准溶液时，分两步稀释，以得到标准储存液。用移液管或吸量管分别吸取砷标准溶液1mL、锑标准溶液10mL溶于100mL的容量瓶中，用二次去离子水定容，配制成10μg/mL的砷、锑标准中间液。再吸取1mL配制好的10μg/mL的砷、锑标准中间液于100mL容量瓶中，用二次去离子水定容。

(3)检定用砷、锑标准混合溶液的配制

用移液管或吸量管分别吸取100ng/mL砷、锑标准储存液0mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中，分别加入100g/L的硫脲溶液20mL、浓盐酸10mL，用二次去离子水稀释至刻度。

(4)5%盐酸溶液的配制

用量筒量取50mL的浓盐酸，加入约200mL二次去离子水稀释，然后移入1000mL的容量瓶中，用二次去离子水定容。

(5)硼氢化钾溶液的配制

硼氢化钾的浓度由被测元素浓度确定，载液酸浓度由硼氢化钾的浓度确定，最终废液呈酸性。日常检定中，配制1.5%的硼氢化钾溶液基本满足检定要求。具体配制方法是:在电子天平上称取15g硼氢化钾溶于预先加入5g氢氧化钾的200mL二次去离子水中，搅拌至溶解，用玻璃棒引流转移至1000mL容量瓶中，再用二次去离子水稀释至刻度。

3.溶液配制中的注意事项

(1)对溶液配制时所使用的玻璃量具根据分析方法的不同进行清洗。测定微量元素用的玻璃器皿，首先用毛刷蘸水刷洗，用水冲去可溶性物质及刷去表面黏附的灰尘，接着将滴管、吸量管、小试管等浸于10%硝酸溶液中8h以上，然后用纯水冲净。洗净的玻璃器皿倒置时，水流出后器皿壁应不挂水珠。至此再用少量纯水刷洗玻璃器皿3次，洗去自来水带来的杂质，自然沥干。

(2)要注意配制的溶液的单位是质量浓度还是体积浓度。

(3)固体试剂在烧杯中溶解后，用玻璃棒引流移入容量瓶，用二次去离子水少量多次清洗烧杯和玻璃棒，将清洗用水也倒入容量瓶，烧杯和容量瓶至少要清洗3～4次。

(4)定容时，先加二次去离子水稀释至约3/4体积，再将容量瓶平摇几次(切勿倒转摇动)，作初步混匀。接着将二次去离子水加至接近刻度处，再一点点加入，使溶液的凹面与容量瓶刻线相切。然后用玻璃塞塞好，来回颠倒容量瓶数次使溶液充分混合均匀。

(5)使用移液管或吸量管量取试剂时，要先用欲取溶液淋洗2～3次后方可操作。

(6)吸取溶液时，移液管或吸量管的下口插入欲取的溶液中不能太浅或太深，太浅会产生吸空，把溶液吸到洗耳球内弄脏溶液，太深又会使管外黏附过多溶液。

(7)为减少测量误差，吸量管每次都应将最上面的刻度作为起始点，往下放出所需体积，而不是放出多少体积就吸取多少体积。除吹出式吸量管外，残留在吸量管末端的少量溶液，不可用外力强行使其流出。

(8)容量瓶使用前要进行试漏，即在瓶内装入自来水到标线附近，盖上塞，用手按住塞，倒立容量瓶，观察瓶口是否有水渗出，如果不漏，把瓶直立后，转动瓶塞约180°后再倒立试一次。

(9)不要用容量瓶长期存放配好的溶液，配好的溶液如果需要长期存放，应该转移到干净的磨口试剂瓶中。

(10)容量瓶长期不用时应该洗净，把塞子用纸垫上，以防时间长后，塞子打不开。

(11)还原剂浓度由试样来定，载流液浓度由还原剂浓度来定，最后废液呈酸性。如果不是酸性，硼氢化钾会在管道压力最低处沉淀，而后堵塞。

(12)实验室内不能放置食物，以免交叉感染。

(13)如对自己所配硼氢化钾溶液和载流液浓度存怀疑态度，可用pH试纸测试一下，如废液呈酸性，则满足实验要求；如废液呈碱性，则硼氢化钾溶液浓度过高。

(14)标准储存液也可用5%盐酸来制备，溶液性质会更加稳定，可保存较长时间。

4.原子荧光用溶液的保存

除标准储存液在0～5℃条件下可保存6个月外，其他溶液最好现用现配。