现代高效液相色谱使用3-10μm柱填料，为达到适用的流动相流速，高压泵需提供几十兆帕或数百大气压力的柱前压。因而HPLC仪比其他类型的色谱仪要复杂和昂贵。

一 流动相储器和溶剂处理系统

现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK）特种塑料制成的容器。每个储器容积500-2000mL。储器位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。

分离可用等度淋洗方式，即使用单一恒定组成的溶剂为流动相；亦常采用梯度淋洗以提高分离效率和速度，这时采用两种或三种极性差别较大的溶剂为流动相。后者适用于组分保留值差别很大的复杂混合物分离，淋洗开始后，各溶剂的流量比例按线性或阶梯形程序变化，逐步增加强溶剂体积比例以提高流动相洗脱强度。梯度淋洗缩短分离时间，但并未牺牲先洗出峰的分离度。梯度淋洗效果类似于气相色谱的程序升温技术。现代高效液相色谱仪一般装有适用梯度淋洗的两种或多种溶剂流量比例调节阀和混合器。

二 高压泵系统

通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供（50一500)×105Pa的柱前液压，输出无脉动恒定的液流，流速范围0.1一10mL·min-1；流速控制精度0.5％或更好，系统组件耐腐蚀（密封性良好的不锈钢或氟塑料）。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优缺点。

1．往复柱塞泵

现在90％的商品HPLC仪安装往复柱塞泵系统，其泵体由小的溶剂室、宝石活塞杆、改变活塞冲程或往复频率，即改变电机转速以调节泵的流量。单柱塞泵由于吸、排液间隔导致输出液脉动，这是它的缺点。实际应用常采用双柱塞、三柱塞并联或串联泵，并附加阻尼器可提高输出液流量稳定性。往复柱塞泵的优点是泵内体积小，一般是0.05-1mL，易于更换溶剂和清洗；输出液压高（＞700×105Pa)；适用梯度淋洗；流速恒定，且流速与柱反压和溶剂黏度无关。

2．其他类型泵

气动放大泵又称为恒压泵，其工作原理与水压机相似，以低压气体作用在大面积气缸活塞上，压力传递到小面积液缸活塞，利用压力放大获得高压。气缸活塞与液缸活塞面积之比为压力放大倍数，如为50:1，则压力放大50倍。这种泵结构简单，成本低；输出恒定液压，当系统阻力不变时可保持恒定流速。其缺点是液缸体积大（约70mL)，更换溶剂操作不方便。

螺旋注射泵又称为排代泵，其结构类似于医用注射器，由一个大体积液体室和柱塞组成，步进电机通过螺旋杆传动机构推动柱塞输出高压液体。液缸容积200-500mL，输出液体压力达（500-1500)×105Pa。步进电机由电子器件调节转速以控制输出稳定流量，与系统反压和溶剂黏度无关。此外，输出流量无脉动。其缺点是体积容量有艰，改换溶剂非常不方便。

3．流速控制和程序系统

作为输液泵系统组成部分，除了泵本身外，还包括调控梯度淋洗多元流动相流量的比例调节阀和混合器；进一步稳定流速的脉动阻尼器；泵启动时快速排除泵系统空气的放空阀，防止空气进入色谱系统导致系统稳定时间延长；进一步除去各种固体残渣的过滤器；柱前压超过控制极高值时自动停泵的反压控制传感器等。商品HPLC仪泵系统都装有计算机控制系统，调控、测定、显示流速、柱前压及泵的运行模式（恒压或恒流等）和状况等，自动调节泵的电机运转速度以提高或降低流量实现与设定值一致。多元比例阀开关、程序梯度变化亦由计算机系统控制。

三 进样系统

通常高效液相色谱仪有三种进样装置。一种是采用硅橡胶或亚硝基氟橡胶作隔垫片的注射器进样口，用高效液相色谱专用注射器取一定体积试样穿过垫片注入色谱柱头。当色谱柱前压超过150×105Pa时，高压下注射进样可能引起溶剂泄漏，此时可采用停流进样。这种进样方式简单，但进样重现性差，其精度很少超过2%-3%，应用逐渐减少。最广泛的进样方式是高压六通阀进样，带定量管的Rheodyne手动进样阀是商品仪器的组成部分，其原理与气相色谱六通阀相似，可在500×105Pa高压下进样。定体积试样管0.5-100μL可变换，制备色谱为0.1-5mL。进样精度可达千分之几。第三种是自动进样系统，现代高效液相色谱仪亦装有计算机程序控制的自动进样器，带定量管的试样阀取样、进样、复位、试样管路清洗和试样盘转动，全部按预定程序自动进行，一次可连续进行几十至上百个试样分析，适用于大量试样自动化分析操作。

四 高效液相色谱柱

色谱柱是色谱分离的核心，是色谱仪最重要的组件之一。一般为内壁抛光的不锈钢管，偶有厚壁玻璃管，但只能耐40×105Pa以下压力。全世界有许多制造商提供数百种不同填料或固定相、规格和型号的色谱柱。

1．色谱柱类型

现代高效液相色谱柱按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型，后两者之间尚无公认的界线。95％以上HPLC柱长度为10-30cm。柱子通常为直型，欲增加长度可将两根或多根柱子连接在一起。分析柱内径2-6mm，填料粒径5或10μm。现在应用最多的分析柱是25cm长，内径4.6mm，填料粒径5μm，其柱效为每米40000-60000块理论塔板。HPLC柱头装有不锈钢烧结材料的微孔过滤片，阻挡流动相中微粒杂质以保护色谱柱。柱出、入口一般用细内径（(0.13mm)、厚壁（1.5-2mm)不锈钢管连接，以降低柱外死体积。

2．保护柱

一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去试样中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。此外，在液液分配色谱中，保护柱可作为流动相对固定液的饱和器，以降低分析柱上固定液的流失。

3．柱恒温器

对多数应用，色谱柱在室温下操作而不必严格控制温度。然而严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。大部分现代色谱仪装备了色谱柱恒温箱，可控制温度在室温到100或150℃，其精度在十分之几摄氏度左右。亦可用恒温水浴保温夹套保持色谱柱恒定温度。

4．柱填充技术

装填高效液相色谱柱需专门设备，装柱技术难度较大，针对不同填料需理论分析和丰富的实践经验。HPLC使用者多数是根据需要购买不同规格、型号商品色谱柱，其价格现一般为每根1000-5000元人民币。部分有一定技术基础的实验室，具有装柱设备并掌握装柱技术。根据填料粒径大小采用干法或湿法装柱。粒径大于20μm，采用类似气相色谱的干法装柱，实际上这种方法已很少使用。目前大多数采用10μm以下填料，以称为等密度匀浆湿法装柱。匀浆装柱机由匀浆槽和高压泵组成，根据填料类型，常采用密度、黏度较大的溶剂作匀浆、润湿剂，如二氧六环、环己烷、四氯化碳、四氯乙烯、四滨乙烷等。根据填料，采用不同类型、配比匀浆剂，在超声浴中制备半透明匀浆液，转入匀浆槽，然后，根据填料性质加入不同加压介质或顶替液，如己烷、甲醇、丙酮或水，开启高压泵输入顶替剂加压（200-500)×105Pa范围。良好的装柱技术、高质量填料、小的死体积柱头结构等是获得高效柱的基本因素。