一 高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较

（一）基本特点

1．高效、高速、高灵敏度

高效液相色谱法与气相色谱法相似，为仪器分析技术，具有高速、高效、高选择性、高灵敏度的特点，区别于低速、低效、无在线检测器、非定型仪器的经典液相色谱法。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。高压泵输液流动相线速可大于100cm·min-1。例如，氨基酸分离，用经典柱色谱法需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而HPLC,1h之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb-ODS(5μm）的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。

2．填料粒径和流动相性质影响色谱柱效

根据速率方程，流动相传质系数Cm正比于固定相粒径平方（(dp2)，高效液相色谱柱填料粒径3-10μm，比经典柱液相色谱、气相色谱填料粒径≧100μm小得多，导致柱效升高1-2数量级。HPLC填充毛细管柱已获得每米106理论塔板数。理论上分析，液体比气体黏度约高100倍，而扩散系数低105倍，低传质速率抵消低扩散，液相色谱柱效可比气相色谱高103倍，还有很大发展空间。但技术难度和仪器设备比气相色谱复杂，设备成本高得多。

3．局限性

从目前发展来看，高效液相色谱法尚缺少灵敏度高的通用型检测器；另外，使用有机溶剂为流动相污染环境，梯度洗脱操作复杂等是其局限。

（二）操作条件

1．流动相对分离选择性的影响

高效液相色谱分离温度与经典柱色谱相似，通常为室温，分离在液相中进行；而气相色谱分离一般在高温、气相中进行。液相分子间作用力强度比气相高104左右，液相色谱分离过程流动相与分离溶质分子间亦存在相互作用，改变流动相的类型和组成是提高分离选择性的重要手段；而气相色谱流动相对分离选择性影响很小，主要是改变固定相来提高分离选择性。

2．柱外效应

液体高戮度导致柱管中心溶质迁移比管壁附近高，使色谱系统连接管柱外效应增大，而气相色谱中气体高扩散性补偿了这种差异；此外，HPLC柱填充密度高，柱长较短，只有气相色谱的1/10-1/20，柱体积占色谱系统总体积比例较小，控制色谱系统连接管内径≤0.25mm，降低柱外效应比气相色谱更为重要。

3．操作压力

HPLC在高压下操作，柱前压一般为（50-350)×105Pa或750-5000lbf/in2（磅力每平方英寸，psi),(105Pa≈0.1MPa≈1大气压；1lbf/in2≈0.07×105Pa)，超高效柱已使用≧800×105Pa柱前压。经典柱色谱在常压或低压下操作；气相色谱亦属低压，柱前压一般＜5×105Pa。高效液相色谱仪器和运行成本均高于气相色谱。

（三）适用范围广

气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20%。高效液相色谱可分离分析占有机物总数近80％的高沸点、热不稳定、生物活性、高分子化合物及无机离子型化合物等。高效液相色谱法在生物和医药学领域应用最为普遍。气相色谱法在石油加工过程应用较多，在气体分析上占有其他色谱法不可替代的位置。常压或低压经典液相色谱具有操作简单、成本低的优点，作为制备分离技术，无论是实验室或工业规模均具有重要应用价值。

二 高效液相色谱法分类和正反相色谱体系

高效液相色谱分离机理多种多样，比气相色谱复杂得多。根据色谱固定相和色谱分离的物理化学原理或分离机理，主要有下列四种类型。

1．吸附色谱（adsorptionchromatography)

用固体吸附剂为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样各组分在吸附剂上吸附性能差异实现分离。

2．分配色谱（partitionchromatography)

用涂渍或化学键合在载体基质上的固定液为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样各组分在固定相中溶解、吸收或吸着能力差异，即在两相中分配性能差异实现组分分离。

3．离子交换色谱（ion一exchangechromatography)

用含离子交换基团的固定相，以具有一定pH含离子的溶液为流动相，基于离子性组分与固定相离子交换能力差异实现组分分离。

4．体积排阻色谱(sizeexclusionchromatography)

用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按组分分子体积差异，即分子在固定相孔穴中体积排阻作用差异实现组分分离，亦称为凝胶色谱（gelchromatog-raphy)。

需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理，如分配色谱也可能存在某些吸附作用，乃至离子交换作用；离子交换色谱可能存在吸附或分配作用，常可观察到存在多种保留机理的色谱过程。

根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系或方法。反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性，最初形成于液液分配色谱，现已广泛应用于其他各种色谱方法。早期液相色谱工作者以强极性的水、三乙二醇等涂渍在硅胶或氧化铝上为固定相，以相对非极性的正己烷、异丙醚为流动相。由于历史原因，这类色谱现称为正相色谱（nor-mal-phasechromatography,NPC)。在反相色谱（rreversed一phasechromatog-raphy,RPC)中，固定相是非极性的，通常是烃类，而流动相是相对极性的水、甲醇、乙睛。正相色谱中极性最小的组分最先洗出，因为大部分情况下是溶于流动相中，流动相极性增加，溶质洗出时间减少。相反，反相色谱中极性最强的组分首先洗出，流动相极性增加，溶质洗出时间增加。硅胶吸附色谱与正相色谱相似，大致可视为正相色谱体系。正反相色谱概念对预侧溶质洗出顺序、评价色谱固定相性能、分离方法选择和分离操作条件优化具有重要实用价值。

上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离。各色谱方法在相关领域应用互相补充，一般相对分子质量大于10000的溶质采用排阻色谱分离，现在也可用反相分配色谱分析。较低相对分子质量的离子性化合物，广泛采用离子交换色谱。低分子中等极性、非离子性溶质及同系物最好使用分配色谱，主要是各种键合相色谱。吸附色谱常用于分离非极性化合物、结构异构体及不同类化合物分离，如脂肪醇与烃分离。各种色谱方法大致适用分离的化合物类型，其应用领域有些相互部分交叠。