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大多数精氨酸转甲基酶(PRMTs)和具有SET结构域的赖氨酸转甲基酶是GST融合蛋白。这些转甲基酶是应用标准的分析生物技术克隆到pGEX载体上,再将这些重组体转到BL21的感受态细菌中表达成蛋白质。
(1) 将转化后的大肠杆菌,挑单克隆至5ml的LB(含50μg/ml氨苄青霉素)中,37℃振荡(250rpm)过夜。
(2)将5 ml过夜培养的菌液转移至50ml的LB(含50μg/ml氨苄青霉素)。
(3) 37℃震摇1-2h至OD,达0. 5。
(4)加50 μ1 0. 1 mol/L IPTG诱导重组蛋白的表达。
(5) 37℃下,继续培养4h (250rpm)。
(6)收集菌液,4℃ 3000g 10min(菌液可以在-70℃保存)。
(7)用5ml冰预冷的1×PBS重悬菌。
(8)超声20s,每超声0.5s间隔0. 5s。
(9) 4℃、10 000g离心15 min。
(10)用冰预冷的1×PBS洗一次琼脂糖珠,在1. 5 ml EP管中加30μl漂洗好的珠子和步骤9中的上清。
(11)在4℃下,颠倒混匀管子lh。
(12)用冰预冷的1×PBS洗3次珠子。
(13)加入新鲜配置的洗脱液100μ1,4℃、颠倒混匀15 min。
(14) 700g离心5s,小心吸弃上清,此上清含有活性酶。
(15)样品4℃保存1-2天或者直接使用。
(16)取出一部分上清,确定蛋白已经纯化成功。加2μl6×蛋白上样缓冲液至10μl纯化的蛋白样品中,95℃煮5 min后,10%的SDS - PAGE胶,用Tris-甘氨酸缓冲液100V 1小时。用考马斯亮蓝染液染色30min,然后用30%甲醇和10%冰醋酸脱色1h。
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