革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（HansChristianGram,1853^1938）于1884年发明的，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯氏菌之间的关系。根据各种细菌对这种染色法的反应不同，可把细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类。因此，该方法对于细菌的分类、鉴定及生产应用都有重要意义。革兰氏染色法的原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，革兰氏阳性菌的细胞壁肤聚糖层厚，交联而成的肤聚糖网状结构致密，经乙醇脱色处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性能降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色；而革兰氏阴性菌肤聚糖层薄，网状结构交联少，脂类含量较高，经乙醇处理后，脂类被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，使细胞脱色。此时，再经番红或沙黄等红色染料复染后细胞呈红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液、媒染剂（mordant),脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain)。碱性染料初染液的作用如细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystalviolet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使染料不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类群，常用的复染液是番红。

在革兰氏染色中，有两个值得注意的问题。一是酒精脱色的时间要掌握恰当，随涂片厚薄不同，脱色的时间也不完全一样，一般以不溶出色素为止。若脱色过度则革兰氏阳性菌被误染为革兰氏阴性菌，而脱色不够时革兰氏阴性菌则被误染为革兰氏阳性菌。二是培养物的老幼对染色结果也有影响，革兰氏染色检查的菌必须是新培养物。如革兰氏阳性菌培养时间过长或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈革兰氏阴性反应。

1.实验材料

菌种：培养10-12h的枯草芽抱杆菌及大肠埃希氏菌。

仪器及其他：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、玻片架、75％酒精消毒缸、镊子、无菌水、草酸按结晶紫、Lugol碘液、95％酒精、番红染液、吸水纸、特种蜡笔、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）。

2.实验步骤

(1)涂片取事先准备好的载玻片于实验台上，用取待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。

(2)干燥将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

(3）固定固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处快速地来回通过2-3次，共2-3s，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过600C)，放置待冷后，进行染色。

(4）初染在涂片薄膜上滴加草酸按结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

(5)水洗斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

(6）媒染吸取碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色1-2min，紫色部分变黑为止。

(7)水洗斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

(8）脱色斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，需时20-30s，随即水洗。

(9）复染在涂片薄膜上滴加番红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min.

(10）水洗斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

(11)干燥、观察用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。