由于皮肤干细胞的存在使得皮肤具有极强的修复和再生能力。目前研究较多的主要有表皮干细胞（keratinocyte stem cells, KSCs）和毛囊干细胞（follilar stem cells)。皮肤干细胞的分离主要利用目前发现的相对特异的表面标志（如整合素家族成员和角蛋白家族成员）结合流式细胞术进行。

一、人角质形成细胞的分离与培养

角质形成细胞（keratinocyte, KC）是构成皮肤表皮的主要细胞，可产生多种细胞因子，参与固有免疫应答及皮肤炎症反应，其增殖、分化维系着表皮正常结构和生理功能。角质形成细胞的体外培养技术是建立角质形成细胞库必不可少的步骤，也是构建皮肤组织工程皮肤的先决条件。

【材料】

1．组织来源5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片。

2．消化液2.5g/L的Dispase酶,0.25％胰蛋白酶。

3．培养基配方和制备人角质形成细胞无血清培养基：DMEM培养基含有 2.5 mg/L牛垂体浸出液、5 ug/LEGF ,438 mg/L谷氨酰胺。

4．实验器材 眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、水浴锅、200目尼龙滤网、50m1和15 ml离心管、手术刀、解剖剪、解剖镊。

【方法】

1．取材将包皮切成0.5 cm x0.5 cm的皮片。

2．消化将皮片浸入浓度为2.5g/L的Dispase酶中，4℃过夜，次日用镊子和眼科剪仔细分离皮肤和皮下组织，去除脂肪和疏松结缔组织。分离出的表皮块用0.25％胰蛋白酶，37℃水浴锅内振荡消化20分钟，加入含10％胎牛血清的培养基终止消化。

3．分离细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。

4．接种与培养细胞计数，以3 x 10⁶/ml密度接种至培养板上，置37℃ 5% C0₂饱和湿度的孵箱中培养。每隔2～3天传代1次。

【结果】

角质形成细胞在6～24小时内开始贴壁，细胞以圆形为主，随着培养时间的延长，细胞开始伸展。3天左右可见数个角质形成细胞形成的小集落，四周可见卫星样表皮细胞增殖，多数细胞为多角形，细胞的均质性和透明度强。9天左右细胞融合达90%，细胞呈典型上皮样特征，核质比高，细胞排列紧密，轮廓清楚，折光性好。

【注意事项】

1．分离皮肤和皮下组织时，要充分去除脂肪和疏松结缔组织。

2．分离表皮的消化过程在37℃水浴锅内，振荡条件下进行。

二、表皮干细胞的分离与培养

表皮干细胞位于表皮的基底层，具有强大的增殖分化潜能，是皮肤的专能干细胞，具有强大的增殖分化潜能，是皮肤发生、修复及重建的种子细胞。在体外可以分化成表皮全层细胞。通过不对称分裂，表皮干细胞维持了终生的自我更新能力。尽管目前还没找到表皮干细胞特异性表面标志，但采用IV型胶原铺板选择性黏附，能得到较纯的表皮干细胞。这些生物学特性使表皮干细胞成为组织工程皮肤的首选种子细胞。

【材料】

1．组织来源5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片。

2．培养用试剂

（1）D-Hanks,PBS液。

(2）消化液：2.5g/L dispase酶,0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备无血清培养基：DMEM培养基含有1% BSA,20ng/ml EGF,5ug/ml胰岛素、20ng/ml IGF-1,20ng/ml LIF,0.05ug/ml氢化可的松、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀、解剖剪、解剖镊。

【方法】

1．取材无菌条件下处理包皮皮片，去除皮下脂肪层，PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小0.5cmx0.5cm的皮片，置于培养皿中。

2．消化加入0.25％中性蛋白酶,4℃消化14～16小时，弃上清液，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化，37℃水浴锅内振荡10分钟，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。

3．分离细胞反复吹打，将细胞悬液通过200目尼龙网过滤。滤液经1000r/min，离心10分钟，弃上清液，收集细胞。

4．接种与培养将细胞以3x10⁶/ml密度接种至铺有W型胶原的培养板上，加入表皮干细胞培养基，轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有W型胶原的培养瓶中，置于37℃,5% C0₂饱和湿度的孵箱中培养。

【结果】

倒置镜下观察，黏附在W型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，培养2～3天细胞开始分裂，4～5天后出现许多细胞克隆或集落。

【注意事项】

培养瓶中预先铺有1V型胶原，利用细胞外基质差速贴壁的特性分离表皮干细胞。

三、毛囊干细胞的分离与培养

毛囊干细胞具有其他成体干细胞的共性，包括慢周期性、未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。另外，当相邻部位受到损伤后，毛囊干细胞可从原位的隆起部迁出，参与损伤部位的修复。毛囊干细胞在体外可诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等多种类型细胞。植入体内可分化形成神经元、黑色素细胞和角化细胞等。毛囊中的干细胞可以产生表皮，尤其在外伤或烧伤后能重建表皮毛发。毛囊干细胞表达间充质干细胞相对特异的表面标记物CD29,CD44,CD90,CD105 (SH-2),CD73 (SH-4）表面抗原，不表达CD31,CD34,CD45,HLA-DR,K15等表面抗原。

【材料】

1．组织来源 人头皮标本。

2．培养用试剂

（1）Hanks,PBS液。

(2）消化液：0.25％中性蛋白酶、胶原酶D。

3．培养基配方和制备无血清培养基：DMEM培养基含有1% BSA,20ng/ml EGF,5ug/ml胰岛素、20ng/ml IGF-1,20ng/ml LIF,0.05ug/ml氢化可的松、100U/ml青霉素和100ug/ ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、400目尼龙网、50ml和15 ml离心管、手术刀、解剖剪、解剖镊。

【方法】

1．取材头部备皮后予70％乙醇中清洗，尽量除去皮下脂肪。将头皮片切成0.5cmx0.5cm皮片。

2．消化加入0.25％中性蛋白酶,4℃消化14～16小时，吸弃上清液，分离表皮和真皮层。用镊子从皮下组织拉出毛囊，将含有毛囊中下部的皮下组织剪碎，在37℃缓慢搅拌的条件下加入胶原酶D,37℃孵育6～8小时。

3．分离细胞细胞悬液经400目尼龙网过滤，收集被尼龙网截留的毛乳头，PBS离心洗涤3次，弃上清液，收集细胞。

4．接种与培养将细胞以3 x 10⁶/ml密度接种于预先铺有N型胶原的培养瓶中，置于37℃,5% C0₂孵箱中培养，每3天换液。

【结果】

培养3～5天，细胞开始增殖，形态为多边形，呈典型的铺路石样，培养7～10天，细胞克隆形成。

【注意事项】

1．取得的材料要尽量新鲜。

2．体外分离培养的人毛囊干细胞生长迅速，细胞外基质差速贴壁法在表皮干细胞及毛囊干细胞等的分选中的应用，证实是一种简单有效的干细胞分选办法。