心肌干细胞（cardiac stem cells,CSCs）具有自我更新、形成克隆和多能性的特征，并能分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。用不同的消化方法来分离心脏组织中的细胞，将获得的细胞置于心肌干细胞培养液中培养。以c-kit和Sca-1作为心肌干细胞标记，用流式细胞分离技术纯化细胞，建立重复性好、稳定性高的心肌干细胞体外分离、培养和纯化方法。

一、心脏中心肌干细胞的分离与培养

成体心肌干细胞存在于发育成熟机体心脏，是组织中具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞。从大鼠心肌中分离培养出心肌干细胞，对其表型进行鉴定、分析，并可分化为搏动的心肌细胞，表达心肌特异性结构蛋白。

【材料】

1．组织来源3日龄新生SD大鼠。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2）消化液：0.25％胰蛋白酶90.1% Ⅱ型胶原酶（DMEM培养液配制）。

3．培养基配方和制备DMEM培养基含20% FCS,O.102g/L胰岛素、0.11 mmol/L β-巯基乙醇,100U/ml青霉素和100ug/ ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿。

【方法】

1．取材出生后3天的新生大鼠，断颈后置于75％的乙醇，无菌条件下取心脏，剪成0.5cmxO.5cm的小块，无钙镁PBS冲洗3次。

2．消化加入0.25％胰酶消化5分钟，吸出消化液，加入0.1 % Ⅱ型胶原酶消化5分钟，弃去消化液，上述交替消化过程重复3次。加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。

3．接种与培养用吸管小心将心肌组织碎块转移入培养瓶中，尽量在瓶底均匀铺开，然后加入培养液约1 ml，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养12小时，加入培养液4ml，继续培养。

4．纯化细胞心肌干细胞培养传三代后进行流式细胞仪表面标记法分选。4℃条件下1500r/min离心10分钟，弃上清液；按10⁷个／40 ul细胞浓度加入PBS重悬细胞，按10⁷个/10ul加生物素抗体（c-kit,CD29,CD90 CD34,CD45)，充分混匀，4℃孵育10分钟。PBS洗涤细胞，加入细胞悬液，上机检测，流式细胞仪筛选分选c-kit,CD29,CD90为阳性表型，CD34,CD45为阴性表型的心肌干细胞。

【结果】

心肌组织碎块种植入培养瓶，2～3天后可见有细胞自心肌组织碎块的边缘爬出，并沿着组织碎块的周围呈同心圆向外围生长。原代及P1代细胞常有杂质细胞，其形状及大小与心肌干细胞明显不同，传代至P2及P3代时，这些细胞逐渐死亡和消失，得到了较纯的CSCs。传代后细胞贴壁迅速，分选后的干细胞经过1～2天的滞留期后，生长迅速，细胞形态多样。贴壁生长的细胞形态相对均一。P1代细胞及之后的传代细胞的生长类似于骨髓间充质干细胞的旋涡状生长。在传代的过程中，未见到干细胞向搏动的心肌细胞的分化，一直．保持心肌干细胞旺盛的分裂和增殖的特征。

【注意事项】

1．培养的原代细胞混杂，传2代后的细胞较纯，形态均一。

2．细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，一般每份样品要求的细胞数为5x10⁵～lx10⁶/ml。

二、骨髓中的心肌干细胞的分离与培养

骨髓中的心肌干细胞取材容易、不受伦理道德限制并且移植后无免疫排斥反应，因此，骨髓中的心肌干细胞有望成为治疗心肌损伤等疾病模型的理想细胞来源。

【材料】

1．组织来源4周龄SD大鼠。

2．无钙镁PBS (CMF-PBS )。

3．培养基配方和制备L-DMEM培养基含10% FBS,100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、300目尼龙网、注射器。

【方法】

1．取材大鼠的股骨和胫骨，直接用含10％的FBS的L-DMEM培养基反复冲洗，尽量把干骺端的骨髓冲干净。

2．纯化细胞冲洗后收集到的骨髓细胞悬液，以c-kit, Sca-1作为干细胞标记，流式细胞仪筛选细胞。4℃条件下1500r/min离心10分钟，弃上清液；按10⁷个／40ul加入PBS重悬细胞，按10⁷个／10ul加生物素标记抗体［抗-CD4，抗-CD8a，抗-CD45R，抗-Gr21，抗-Ter-119（≤1ug/106细胞），抗-CDllb(≤0.25ug/106细胞）]混匀，4℃孵育10分钟。PBS洗涤细胞，加入细胞悬液，上机检测，流式细胞仪筛选c-kit,Sca-1阳性细胞。

3．接种与培养将细胞以3 x 10⁶/ml密度接种于培养瓶中，加入DMEM培养基于37℃,5% CO₂孵箱中培养，每3天换液。

【结果】

原代培养的骨髓源性的心肌干细胞贴壁生长，培养2天，细胞伸展，成纤维细胞样生长，培养7～8天，细胞达到90％融合，这期间细胞形态不发生变化。

【注意事项】

1．单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键。如遇有细胞团块，用300目尼龙网过滤后，再上机检测。

2．保证细胞样品有足够的细胞浓度。