2.液液分配色谱固定相

液液色谱固定相由两部分组成，一部分是惰性载体，另一部分是涂渍在惰性载体上的固定液。

在液固色谱中使用的固体吸附剂，如全多孔球形或无定形微粒硅胶、全多孔氧化铝等皆可作为液液色谱固定相的惰性载体。要求其比表面积50～250 m²/g，平均孔径10～50nm。载体的比表面积太大，会引起不可忽视的吸附效应，从而引起色谱峰峰形拖尾。

液液色谱中使用的固定液如表9-11所示。

表9-11液液色谱法使用的固定液

在惰性载体表面涂渍固定液有两种方法，一种是用含固定液的溶液浸渍惰性载体，再用蒸发法缓慢除去溶剂，此法固定液涂渍在载体上比较均匀。另一种方法是先将惰性载体装填在色谱柱中，再用含一定量固定液的流动相流经柱子，使固定液吸附在惰性载体上，此法若达稳定状态需较长时间，且固定液不易达到均匀分布。固定液涂渍量为每克载体0.1～1.0g，当涂渍量每克载体＞0.3g为重负载柱。液液色谱柱的柱容量比液固色谱柱大一个数量级，每克固定液为10-2～10-4g(样品)，而峰形无明显的扩展。

经过在惰性载体上机械涂渍固定液后制成的液液色谱柱，在使用过程由于大量流动相通过色谱柱，会溶解固定液而造成固定液的流失，并导致保留值减小，柱选择性下降。为了防止固定液的流失，可采取以下措施：

①应尽量选择对固定液仅有较低溶解度的溶剂作为流动相。

②流动相进入色谱柱前，应预先用固定液饱和，这种被固定液饱和的流动相再流经色谱柱时就不会再溶解固定液了。

③使流动相保持低流速经过固定相，并保持色谱柱温度恒定。

④进样时若溶解样品的溶剂对固定液有较大的溶解度，应避免过大的进样量。

当采取上述措施后，可延长液液色谱柱的使用寿命，但要完全避免固定液的流失仍然是困难的，当色谱柱使用一定时间后，仍会因固定液的流失而出现保留值减少、柱效下降的现象。现在化学键合固定相的使用日益广泛，已逐渐取代了液液色谱固定相。

(三)流动相

1．高效液相色谱分析中对流动相的要求

在高效液相色谱分析中，除了固定相对样品的分离起主要作用外，流动相的恰当选择对改善分离效果也产生重要的辅助效应。从实用角度考虑，选用作为流动相的溶剂应当价廉，容易购得，使用安全，纯度要高。除此之外，还应满足高效液相色谱分析的下述要求：

①用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性；所用溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。

②选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配。如使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能使用梯度洗脱(因随溶剂组成的改变，流动相的折射率也在改变，就无法使基线稳定)。

③选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。

④选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。使用低黏度溶剂，可减小溶质的传质阻力，利于提高柱效。另外从制备、纯化样品考虑，低沸点的溶剂易用蒸馏方法从柱后收集液中除去，利于样品的纯化。

⑤应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以确保操作人员的安全。

当进行色谱分析时，样品中两个相邻组分(1,2)的分离度R，可按下式计算：

式中，n₂为以第二组分计算的色谱柱的理论塔数；a_2/1为两个相邻组分的调整保留值之比，称分离因子；k₂为第二组分的容量因子。

由上式可知影响R数值大小的，主要有三个因素，即柱效、分离因子和容量因子。

相关链接：液固色谱法和液液色谱法（一）