(一)适用范围

转基因大豆(GTS-40-3-2)及其加工产品由单一作物种类组成的物种结构特异性基因的定性检测。

(二)实验原理

通过多重PCR扩增和基因芯片技术，可以检测转基因大豆(GTS-40-3-2)及其加工产品中由单一作物种类组成的物种结构特异性基因。

(三)术语

基片：基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的“载玻片或其他固体载体”，经过化学修饰制备而成。

基因芯片探针：基因芯片中固定于基质表面、能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子，本部分采用寡核苷酸片段作探针。

定位探针：是一段与待测基因无关的寡核苷酸，通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号，用于点样矩阵的位置的确定。

阳性质控探针：用于样品抽提、PCR、杂交的反应体系的监控，一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针。

阴性质控探针：是一段与待测基因无关的寡核苷酸，用于基因芯片非特异性杂交背景的监控。

基因芯片空白质控点：由不含核酸的点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控。

目标基因探针：用于检测目标基因序列的探针。

信噪比：是杂交信号值与杂交背景值的比值，由图像分析软件自动判读。

(四)主要试剂

使用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。

(1)点样液0.2mol/L碳酸钠。

(2)基因芯片洗脱液0.2% SDS。

(3)基因芯片杂交液1 % SDS, 10×SSPE。

(4)阴性目标DNA对照不含外源目标核酸序列片段的模板。可使用阴性标准物质，并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增。

(5)CTAB提取缓冲液(pH 8.0)称取4.00g CTAB, 16.38g氯化钠，2.42g Tris,1.50g EDTA二钠，4.00g PVP-40，用适量水溶解后，调节pH，定容至200mL，高压灭菌。临用前按使用量加入β-巯基乙醇，使终浓度为2%。

(6)引物和探针转基因大豆的引物序列和探针序列如表5-19所示，对照的引物和探针序列如表5-20所示。

表5-19转基因大豆物种结构特异性基因检测的引物序列和探针序列

表5-20阳性对照(18S rRNA)引物序列和探针序列

(7)多重PCR反应体系多重PCR反应体系的配制如表5-21所示：

表5-21多重PCR反应体系

注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。

(五)主要仪器设备

基因芯片点样仪；紫外交联仪；基因芯片扫描仪：要配备具有分析信噪比的软件；杂交仪；清洗槽；暗室。

(六)检测基因

本方法检测转基因大豆(GTS-40-3-2)及其产品中的Lectin, CaMV 35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因。

(七)检测灵敏度

本方法的检测灵敏度为0.5%,

(八)实验方法与步骤

1. CTAB法提取DNA

(1)称取100mg样品2mL Eppendorf离心管中，加入700uL CTAB缓冲液，涡旋振荡器混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2～3次。

(2)加入700uL的三氯甲烷-异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10 min，期间颠倒混匀离心管2～3次；12000×g离心5 min。

(3)转移上清液至1.5 mL Eppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，于-20℃下静置5 min, 12000×g离心5 min，小心弃去上清液。

(4)加入70％乙醇1000 uL，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下5000×g离心1min,小心弃去上清液；加20uL RNase A酶(10ug/mL)，37℃温育30min。

(5)加入600 uL氯化钠溶液，65℃温浴10min。加入600uL三氯甲烷-Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000×g离心5 min，转移上层水相至1.5 mL Eppendorf离心管中。

(6)加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，干4℃下静置30min; 4℃下12000×g离心10min，小心弃去上清液。

(7)加入1000 uL经4℃预冷的70％乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下12000×g离心10 min，小心弃去上清液；用经4℃预冷的70％乙醇按相同方法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。

(8)加50uL TE缓冲液溶解DNA, 4℃保存备用。

注：转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层。每个样品提取时应做2个提取重复。

2．多重PCR扩增

(1)多重PCR反应参数多重PCR反应参数为：50℃ 5min; 94℃ 5min; 94℃ 10s,55℃ 10s, 72℃ 30s, 35个循环；72℃ 10min; 4℃保存。

注：不同的基因扩增仪可根据仪器的要求将反应参数做适当的调整。

(2)物种结构特异性基因检测多重PCR将转基因大豆的Lectin, CaMV 35S启动子、NOS终止子、CP4-EPSPS和18s rRNA的引物同时加入多重PCR反应体系中。

注：应做PCR试剂对照(即不含DNA模板的PCR扩增反应液试剂)。

3.PCR产物的沉淀

将多重PCR反应产物加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3mol/L NaAC (pH5.2)，置于-20℃避光沉淀30min以上，供基因芯片杂交检测用。

4．杂交

(1)杂交反应沉淀后PCR产物经13000r/min 15min离心，弃上清，避光晾干，加经55℃预热的杂交液6uL,混匀后95℃ 3 min , 0℃ 5min后全部转移到芯片的点样区域，加盖玻片。在杂交舱里加几滴水，以保持湿度。将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进50℃水浴内保温1h。

(2)洗片打开杂交舱，取出芯片，用0.2% SDS冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有0.2 % SDS的染色缸，放置5min，用双蒸水冲洗两遍。室温避光干燥。

5.扫描检测

将杂交后的基因芯片放入扫描仪内扫描，并分析结果，控制扫描仪的软件应具有信噪比的分析功能。

6. 扫描结果的判定

首先阴性质控探针杂交信噪比均值≤3.5，基因芯片空白质控点杂交信噪比均值≤3.5，阳性质控探针杂交信噪比＞5.0判定为杂交合格，在此基础上，目标基因探针杂交信噪比均值≥5.0判定为阳性信号，在3.5～5.0判定为可疑阳性，≤3. 5判定为阴性。

7．可疑数据的确证

对于可疑的数据，确证实验按照转基因大豆GTS-40-3-2定量检测—实时荧光定量PCR技术进行。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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