(五)生物芯片的分类

目前常见的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室。近期又出现了细胞芯片、组织芯片、糖芯片以及其他类型生物芯片等。

1．基因芯片

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)、DNA微阵列(DNA microarray),是生物芯片技术中发展最成熟以及最先进人应用和实现商品化的领域。基因芯片是基于核酸互补杂交原理研制的，该技术系指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)已知碱基顺序的DNA片段(基因探针)固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检侧每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息通俗地说。就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的DNA探针，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作。通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如各种特定基因序列的检测、基因突变和单核苷酸多态性检测，也可用于基因序列测定，也开发用于转基因产品的检测。

基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足：

(1)基因芯片可分为三种主要类型

①固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。

②用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。

③在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。

(2)基因芯片技术的操作原理基因芯片技术的操作原理分为两部分：芯片的制备和样本的检测。

①基因芯片的制备：根据需要检测的外源目标基因设计寡核苷酸探针，用于制备基因芯片。在制备寡核苷酸探针时，一般在其5'或3'端进行氨基修饰，以利于其在玻片表面的固定。另外，对玻片表面进行氨基修饰，然后在氨基修饰后的玻片表面上连接双功能偶联剂，如戊二醛(GA)或对苯异硫氰酸酯(PDC)，制备成基片。探针合成好后．通过点样仪点在基片上，寡核苷酸的修饰氨基将与基片上的戊二醛的另一个醛基发生化学反应,或与PDC分子的另一个异硫氰基发生类似的反应，从而达到寡核苷酸交联固定的目的。为了有利于寡核苷酸探针分子和目标基因片段之间的杂交，通常在所设计的寡核苷酸探针序列的5'端或3'端通常要加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子采用poll-(dT)10作为手臂分子。点样完成后要对芯片进行后处理，后处理的目的主要是为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果(特别是背景)造成影响。

②样本的检测：包括样品制备和标记、杂交反应、信号检测和结果分析。

样品制备和标记：提取纯化样品核酸，尽量去除样品中的抑制物杂质，为了提高检验灵敏度，在对样品核酸进行荧光标记时。需要对待检靶标DNA进行PCR扩增。目前普遍采用的荧光标记方法有体外转录(NASBA)PCR、逆转录(RT)等。目的是在以样品为模板合成相应核酸片段过程中掺入带有荧光标记的核苷酸，作为检测信号源。

杂交反应：杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行杂交产生一系列信息的过程。在合适的反应条件下，靶基因与芯片上的探针根据碱基互补配对形成稳定双链，未杂交的其他核酸分子随后被洗去。必须注意的是标记核酸样品必须变性成单链结构才能参与杂交。因此在杂交之前需要对标记样品进行变性处理，一般采用高温(95～100℃)沸水浴10min然后冰浴骤冷的方法。影响杂交效果的主要因素有杂交温度、杂交时间、杂交液的离子种类和强度等。杂交条件的选择与研究目的有关，如检测基因的差异性表达需要较低温度、长的杂交时间、高严谨性、高的样品浓度，以利于增加检测特异性和检测低拷贝基因的灵敏度；检测基因突变体和单核苷酸多态性(SNP)分析时，要鉴别出单个碱基错配，杂交时需要更高的杂交严谨性和更短的杂交时间。此外还需要考虑探针的GC含量、杂交液的盐浓度、探针与芯片之间连接臂的长度、待检基因的二级结构等因素。一般基因芯片产品对适用范围、杂交体系和杂交条件均有较为详尽的说明。

信号检测：当前主要的检测手段是荧光法和激光共聚焦显微扫描。杂交完成后，将芯片插入扫描仪中对片基进行激光共聚焦扫描，已与芯片探针杂交的样品核酸上的标记荧光分子受激发而产生荧光，用带滤光片镜头采集每一点荧光，经光电倍增管(PMT)或电荷偶合元件(CCD)转换为电信号，计算机软件将电信号转换为数值，并同时将数值大小用不同颜色在屏幕上显示出来。荧光分子对激发光、光电倍增管或电荷偶合元件都具有良好的线性响应，所得的杂交信号值与样品中靶分子的含量有一定的线性关系。

结果分析：由于芯片上每个探针的序列和位置是已知的，对每个探针的杂交信号进行比较分析，最后得到样品核酸中基因结构和数量的信息。

(3)基因芯片技术的特点

①样品制备时，在标记和测定前通常要对样品进行一定程度的扩增，以便提高检测的灵敏度。

②探针的合成和固定比较复杂，特别是对于制作高密度的探针阵列。

③目标分子的标记是一个重要的限速步骤。

④基因芯片检测结果的可靠性与探针种类及其特异性密切相关。

2．蛋白质芯片

蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列，又称蛋白质微阵列(Pro-tein Microarray)，它利用的不是碱基对，而是抗体与抗原结合的特异性，即免疫反应来检测的芯片。蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析：它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列，体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。

(1)蛋白质芯片的制备原理

①固体芯片的构建，常用的材质有玻片、硅、云母及各种膜片等。理想的载体表面是渗透滤膜(如硝酸纤维素膜)或包被了不同试剂(如多聚赖氨酸)的载玻片。外形可制成各种不同的形状。

②探针的制备，低密度蛋白质芯片的探针包括特定的抗原、抗体、酶、吸水或疏水物质、结合某些阳离子或阴离子的化学基团、受体和免疫复合物等具有生物活性的蛋白质。

制备时常常采用直接点样法，以避免蛋白质的空间结构改变。保持它和样品的特异性结合能力：高密度蛋白质芯片一般为基因表达产物，如一个cDNA文库所产生的几乎所有蛋白质均排列在一个载体表面，其芯池数目高达1600个/cm² ，呈微矩阵排列，点样时须用机械手进行，可同时检测数千个样品。

③生物分子反应，使用时将待检的含有蛋白质的标本，按一定程序做好层析、电泳、色谱等前处理，然后在每个芯池里点人需要的种类。一般样品量只要2～10uL即可。根据测定目的不同可选用不同探针结合或与其中含有的生物制剂相互作用一段时间，然后洗去未结合的或多余的物质，将样品固定等待检测即可。

④信号检测分析，直接检测模式是将待测蛋白用荧光素或同位素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号，检测时用特殊的芯片扫描仪扫描和相应的计算机软件进行数据分析，或将芯片放射显影后再选用相应的软件进行数据分析。间接检测模式类似于ELISA方法，标记第二抗体分子。以上两种检测模式均基于阵列为基础的芯片检测技术。该法操作简单、成本低廉，可以在单一测量时间内完成多次重复性测量。

(2)蛋白质芯片技术的特点

①能够快速并且定量分析大量蛋白质。

②蛋白质芯片使用相对简单，结果正确率较高，只需对少量血样标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测。

③相对传统的酶标ELISA分析，蛋白质芯片采用光酶染料标记，灵敏度高，准确性好。另外，蛋白质芯片所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强。

蛋白质芯片在食品分析方面具有较好的应用前景，食品营养成分的分析(蛋白质)，食品中有毒、有害化学物质的分析(包括农药、重金属、有机污染物、激素)，食品中污染的致病微生物的检测，食品中污染的生物毒素(细菌毒素、真菌毒素)的检测等大量工作几乎都可以用蛋白质芯片来完成。

3．芯片实验室

芯片实验室(Lab-on-a-chip)或称微全分析系统(Micro Total Analysis System，或microTAS )是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。它是通过分析化学、微机电加工(MEMS)、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等交叉来实现化学分析检测即实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化这一目标。计算机芯片使计算微型化，而芯片实验室使实验室微型化，因此，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升(uL)甚至纳升(nL)级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域它可以使以前需要在一个大实验室花大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成大量实验；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室由于排污很少，所以也是一种“绿色”技术。

芯片实验室的特点有以下几个方面：集成性，目前一个重要的趋势是：集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀(包括主动阀和被动阀)，微泵(包括机械泵和非机械泵)；微混合器，微反应器，还有微通道和微检测器等。

相关链接：生物芯片检测技术（二）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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