7 分析步骤

7.1 提取

称取1g试样，精确到0.01g，置于50 mL具塞试管中，加入10 mL磷酸盐缓冲溶液(4.6)于液体混匀器上快速混匀1 min，使试样完全溶解。再加入39 mL磷酸盐缓冲溶液后，将试管置于超声波水浴中超声5 min，取出摇匀，用注射过滤器将适量的样品溶液过滤至10 mL具塞试管中，供酶标仪测定。此溶液稀释系数为50。

7.2 测定条件

以下所有操作应在20℃～24℃室温下进行。

7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。

7.2.2 人工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250uL。

7.2.3 四环素族试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。

7.2.4 将测定需用的微孔板(4.1.1)备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。

7.3 测定

测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.1 分别吸取50 uL四环素族标准工作溶液(4.8)和样品溶液等，按模板图位置依次加入各自的微孔底部。

7.3.2 吸取50uL四环素族抗体溶液(4.1.3)于每一个微孔底部，然后，用封口膜密封孔口以防溶液挥发。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育60 min。

7.3.3 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液(但不能使微孔于燥)，然后，立即用洗板溶液(4.7)按7.2.2要求进行洗板。每次弃去洗板溶液后，均应将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥。

7.3.4 迅速加入100 uL四环素族酶标记物溶液(4.1.4)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育15 min。

7.3.5 按7.3.3步骤重复操作。

7.3.6 迅速加入50 uL基质(4.1.5)和50 uL显色剂(4.1.6)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育15 min。

7.3.7 迅速加入100 uL反应停止液(4.1.7)于每一个微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450 nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60 min内读取吸光度)。

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

7.6 监控试验

每次测定均应做一个添加四环素族抗生素标准的空白样品。

8 结果计算

在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(％)，四环素族抗生素标准工作溶液浓度(ug/kg)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的四环素族抗生素浓度后，结果按公式(1)计算：

式中：

X—试样中四环素族抗生素残留量，单位为微克每千克(ug/kg);

c—从标准工作曲线上得到的试样中四环素族抗生素浓度，单位为微克每千克(ug/kg) ;

V—样品溶液的体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所含的试样质量，单位为克(g)。

结果表示到小数点后两位。

注：计算结果应扣除空白值。

9 确证试验

如被测样品中四环素族抗生素残留量的值大于检出限时，应用LC-MS-MS法进行确证。

10 精密度

本部分的精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95％的可信度来计算。

10.1 重复性

在重复性条件下，蜂蜜中四环素族抗生素的含量在15.00ug/kg～200.00ug/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，本部分的重复性限按方程式(2)计算：

1gr＝1.1239 1gm-1.4213······(2)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为微克每千克(ug/kg)。 

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

10.2 再现性

在再现性条件下，蜂蜜中四环素族抗生素的含量在15.00ug/kg～200.00ug/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性(R)，本部分的再现性限按方程式(3)计算：

R＝0.0959 m＋1.4745······(3)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为微克每千克(ug/kg)。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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