1 范围

本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的高效液相色谱、液相色谱-串联质谱的快速测定方法。

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的测定。

2 液相色谱法

2.1 原理

试样中的残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用液相色谱进行检测，外标法定量。

2.2 试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

2.2.1 乙腈：色谱纯。

2.2.2 无水乙酸钠。

2.2.3 冰乙酸：色谱纯。

2.2.4 异丙醇。

2.2.5 对-甲苯磺酸。

2.2.6 乙酸盐缓冲液：称取4.950 g无水乙酸钠及0.950 g对-甲苯磺酸，溶解于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水定容到1000mL。

2.2.7 标准品：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98％。

2.2.8 标准贮备溶液：准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10 mg，用乙腈分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 ug/mL的标准贮备液。

2.2.9 混合标准溶液：用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10 ug/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。

2.2.10 孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒。

2.3 仪器和设备

2.3.1 高效液相色谱仪：配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。

2.3.2 匀浆机。

2.3.3 旋转蒸发仪。

2.3.4 离心机：4000r/min,8000r/min。

2.3.5 振荡器。

2.3.6 超声波水浴。

2.3.7 聚四氟乙烯离心管：2.5mL，50mL，具塞。

2.3.8 微孔滤膜：0.45 um。

2.4 测定步骤

2.4.1 提取、净化

准确称取已捣碎的样品5.00g于50 mL离心管中，先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂(液体20.0 mL)、用匀浆机以8 000r/min的速度均质30 s，再加入提取剂2(固体粉末)，振荡1 min, 4000r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中再加入异丙醇10mL 50℃～55℃水浴旋转蒸干。残留物用1.0 mL流动相溶解，溶解液放入2.5 mL 离心管中，8000 r/min离心5 min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。

2.4.2 绘制标准工作曲线

移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫撮合标准溶液，用流动相稀释成2 ng/mL，50 ng/mL，250ng/mL，500 ng/mL标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。

2.4.3 测定

2.4.3.1 液相色谱条件

a)色谱柱：C₁₈柱，250 mm×4.6 mm(内径)，粒度5 um；

b)流动相：乙腈＋乙酸盐缓冲液(80+20，体积分数)；

c)流速：1.0 mL/min;

d)山柱温：室温；

e)检测波长时间程序：0 min～5.0 min，618 nm；5.0min～12 min，588 nm；12 min～18 min，267nm；孔雀石绿的检测波长为618 nm，结晶紫的检测波长为588 nm,隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为267 nm;

f)进样量：50 uL。

2.4.3.2 色谱测定

根据样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均应在仪器的检测线性范围内。在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间约为孔雀石绿4.0min、隐色孔雀石绿13.6 min、结晶紫5.4 min和隐色结晶紫14.7 min。

2.4.4 空白实验

除不加试样外，按上述测定步骤进行。

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文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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