5 分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 样品提取

取50g试样，经粉碎机粉碎，-20℃冷冻保存。准确称取试样1g～2g(精确到0.001g),加入10mg/L ¹³C₃-丙烯酰胺内标工作溶液10uL(或20uL),相当于100ng(或200ng)的¹³C₃-丙烯酰胺内标，再加入超纯水10mL,振摇30min后，于4000r/m离心10min,取上清液待净化。

5.1.2 样品净化

注：任选下列一种方法进行净化。

5.1.2.1 基质固相分散萃取方法(选择1)：在试样提取的上清液中加入硫酸铵15g,振荡10min,使其充分溶解，于4000r/m离心10min,取上清液10mL,备用。如上清液不足10mL,则用饱和硫酸铵补足。取洁净玻璃层析柱，在底部填少许玻璃棉并压紧，依次填装10g无水硫酸钠、2g硅藻土。称取5g硅藻土Extrelut™20与上述试样上清液搅拌均匀后，装入层析柱中。用70mL正己烷淋洗，控制流速为2mL/min,弃去正己烷淋洗液。用70mL乙酸乙酯洗脱丙烯酰胺，控制流速为2mL/min,收集乙酸乙酯洗脱溶液,并在45℃水浴中减压旋转蒸发至近干,用乙酸乙酯洗涤蒸发瓶残渣三次(每次1mL),并将其转移至己加入1mL0.1%甲酸溶液的试管中,涡旋振荡。在氮气流下吹去上层有机相后,加入1mL正己烷，涡旋振荡，于3500r/m离心5min,取下层水相经0.22um水相滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。

5.1.2.2 固相萃取柱净化(选择2)：在试样提取的上清液中加入5mL正己烷，振荡萃取10min)于10000r/m离心5min,除去有机相，再用5mL正己烷重复萃取一次，迅速取水相6mL经0.45um水相滤膜过滤，待进行HLB固相萃取柱净化处理。HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化。取上述滤液5mL上HLB固相萃取柱，收集流出液，并用4mL80%的甲醇水溶液洗脱，收集全部洗脱液，并与流出液合并待进行BOndEIUt-ACCUCat固相萃取柱净化BOndEIUt-ACCUCat固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化后，将HLB固相萃取柱净化的全部洗脱液上样，在重力作用下流出，收集全部流出液，在氮气流下将流出液浓缩至近干，用0.1%甲酸溶液定容至1.0mL,待LC-MS/MS测定。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱条件

色谱柱为AtIantiSC_l8柱(5um,2.1mmI.D.×150mm)或等效柱。

预柱：C₁₈保护柱(5um、2.1mmI.D.×30mm)或等效柱。

流动相：甲醇/0.1%甲酸(10：90,体积分数)。

流速：0.2mL/min。

进样体积：25uL。

柱温：26℃。

5.2.2 质谱参数

5.2.2.1 三重四极串联质谱仪

检测方式：多反应离子监测(MRM)。

电离方式：阳离子电喷雾电离源(ESl+)。

毛细管电压：3500V。

锥孔电压：40V。

射频透镜1电压：30.8V。

离子源温度：80℃。

脱溶剂气温度：300℃。

离子碰撞能量：6eV。

丙烯酰胺：母离子m/z72、子离子m/z55、子离子m/z44。

¹³C₃丙烯酰胺：母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z45。

定量离子：丙烯酰胺为m/z55,¹³C₃丙烯酰胺为m/z58。

5.2.2.2 离子阱串联质谱仪

检测方式：选择反应离子监测(SRM)。电离方式：阳离子电喷雾电离源(ESl+)。

喷雾电压：5000V。

加热毛细管温度：300℃。

鞘气：N₂,40Arb。

辅助气：N₂,20Arb。

碰撞诱导解离(CID)：10V。

碰撞能量：40V。

丙烯酰胺：母离子m/z72子离子m/z55、子离子m/z44。

¹³C₃丙烯酰胺：母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z45。

定量离子：丙烯酰胺为m/z55,¹³C₃丙烯酰胺为m/z58。

5.3 标准曲线的绘制

将标准系列工作液分别注入液相色谱-质谱/质谱系统，测定相应的丙烯酰胺及其内标的峰面积，以各标准系列工作液的丙烯酰胺进样浓度(ug/L)为横坐标，以丙烯酰胺(m/z55)和¹³C₃丙烯酰胺内标(m/z58)的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液注入液相色谱-质谱/质谱系统中，测得丙烯酰胺(m/z55)和¹³C₃丙烯酰胺内标(m/z58)的峰面积比，根据标准曲线得到待测液中丙烯酰胺进样浓度(ug/L),平行测定次数不少于两次。

5.5 质谱分析

分别将试样和标准系列工作液注入液相色谱-质谱/质谱仪中，记录总离子流图和质谱图及丙烯酰胺和内标的峰面积，以保留时间及碎片离子的丰度定性，要求所检测的丙烯酰胺色谱峰信噪比(S/N)大于3,被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致,同时被测试样中目标化合物的相应监测离子丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表1。

表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

6 分析结果的表述

试样中丙烯酰胺含量按公式(1)内标法计算:

式中：

X—试样中丙烯酰胺的含量，单位为微克每千克(ug/kg);

A—试样中丙烯酰胺(m/z55)色谱峰与¹³C₃丙烯酰胺内标(m/z58)色谱峰的峰面积比值对应的丙烯酰胺质量，单位为纳克(ng)；

f—试样中内标加入量的换算因子(内标为10uL时f=1或内标为20uL时f=2)；

M—加入内标时的取样量，单位为克(g)。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字(或小数点后1位)。

7 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

8 其他

方法定量限为10ug/kg。

相关链接：食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定—稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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