分子标记辅助选择内容包括用分子标记进行种质资源分类和遗传多样性分析，杂交育种亲本选择、杂交后代重组个体筛选等育种环节，以及利用DNA指纹进行新品种保护。

一、利用分子标记技术对亲本评价

(一)利用分子标记进行种质资源遗传多样性分析

作物种质资源所包含的遗传变异是育种的基础材料，对资源的合理分类与准确评价是资源高效利用的前提。种质资源遗传多样性一般用多态性位点数、各位点的等位基因数以及等位基因频率等参数来描述。Yang等(1994)利用SSR标记分析了来自中国和东南亚的140份水稻农家品种和98份改良品种的遗传多样性，研究结果表明，改良品种的等位基因数约为农家品种的60％，而20个在我国大面积种植的优良品种和13个杂交稻亲本的等位基因数约为全部改良品种的60％。另外，根据中国农业大学水稻遗传课题组采用RFLP和SSR标记的研究，栽培稻等位基因数约是野生稻等位基因数的60％。这些研究表明，在野生稻驯化为栽培稻以及随后的栽培稻改良的过程中，大量的等位基因丢失，从野生稻及地方种中发掘优良基因资源具有较好的潜力。例如，控制水稻籽粒大小的GW2基因和抗稻瘟病基因Pi2l等均是从地方种中分离出的基因，在优良品种中已经被选择掉。

(二)利用分子标记预测杂种优势

分子标记还可以用来对品种资源进行分类，确定亲本间遗传距离，并有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。

Thomas等用AFLP标记分析了51个欧洲早熟硬粒型和马齿型自交系，并用之将自交系归入不同的杂优类群；而后又将AFLP标记所表现出的遗传多样性与其系谱数据进行对照。指出AFLP标记不仅可用于自交系的不同杂优类群的划分，而且可用于揭示自交系间的系谱关系。刘希慧利用SSR分子标记分析了广泛应用的12个玉米自交系的遗传多样性，并划分了杂种优势群，结果表明用SSR标记划分杂种优势群与自交系系谱关系基本一致。

Smith等（1990)为探讨不同位点等位变异与杂交种产量的关系，用37个优良玉米自交系配制了310个杂交组合，并用230个RFLP探针对这些自交系的等位性变异进行检测，结果发现杂交种的杂交位点数目与产量决定因子的相关系数高达0.87。在水稻中，Zhang等（2004; 2005; 2006)系统研究了分子标记基因型杂合度与杂种优势间的相关性，并提出用一般杂合度和特殊杂合度来度量杂种基因型杂合性的概念，一般杂合度是指由所有标记检测到的两亲本间的差异，特殊杂合度则指根据单因子方差分析确定的对某一性状有显著效应的标记计算的亲本间差异程度。研究结果发现，基因型杂合度与杂种表现及杂种优势的相关性在不同材料中有较大差异，在美国长粒型品种杂交组合中，一般杂合度与杂种产量呈显著正相关；我国优良杂交稻亲本杂交组合特殊杂合度与杂种优势也有很高的相关性。李任华等(1998)用92个多型性的RFLP分子标记研究水稻釉粳分化与杂种优势的关系，发现分子标记位点杂合度与杂种表现不显著，而用其中的42个与釉、粳分化有关的特异性标记位点计算的杂合度与杂种表现相关。

（三）利用分子标记建立品种DNA指纹

DNA指纹（DNA fingerprint, DFP）技术是一种在单一实验中可以检出大量DNA位点差异性的分子生物学技术。1980年Wyman和White首先在人类基因文库的DNA随机片段中分离出高度多态的重复序列区域。1982年，Bell等又在人胰岛素基因附近发现高度重复序列。1985年，Jeffreys等发现小卫星位点的核心序列并以此为探针获得了第一个杂交图谱，由于其具有和人的指纹相似的个体特异性而被称为DNA指纹图谱。之后，随着分子生物学的发展，DNA指纹技术也在不断发展，并在医学、生物学等多个领域得到广泛应用。在作物遗传育种过程中DNA指纹可以用于新品种登记和品种鉴定，作为该品种的“身份证”保护新育成品种及育种家的权益；此外，分子标记指纹图谱还可以进行品种纯度和重复性检验。当前用来做 DNA指纹图谱的标记主要有SSR, AFLP, SNP等，其中SSR和AFLP比较理想，而SNP更易于自动化。

（四）利用分子标记技术发掘作物野生近缘种优良基因

种质创新是作物育种的基础环节，利用分子标记结合常规回交育种技术，可以进行野生资源优良基因的发掘和利用。由于野生资源中不利基因频率较高，很难直接利用，借助分子标记和高密度连锁图谱，构建渗入系是行之有效的方法。渗入系也被称为染色体片段代换系，是通过系统回交和自交，并利用分子标记辅助选择的手段使供体染色体片段渗入到受体亲本中。由于渗入系的遗传背景与受体亲本大体相同，只有少数渗入片段的差异，渗入系和受体亲本的任何表型差异均是由渗入片段引起的，因此，渗入系的构建可以从栽培植物野生近缘种挖掘和利用新的基因资源。Tanksley研究小组用该方法对番茄5个野生种基因组进行了筛选，在分子标记辅助下，育成了一系列含有野生种不同QTL位点的近等基因系，一些品系的产量、可溶性固体物含量、颜色、果重等指标分别比轮回亲本提高了48％,22％,35％和8％。中国农业大学水稻分子遗传研究课题组，构建了以优良栽培稻品种为遗传背景、以普通野生稻为供体亲本的基因渗入系。利用这些渗入系对野生稻的高产、耐冷、耐旱基因进行了定位，并构建了近等基因系，发现了一批高产、抗逆的基因资源。

二、利用分子标记技术改良作物品种

在作物育种过程中，对杂交后代进行准确鉴定和有效选择至关重要，但是由于基因间存在上位效应或掩盖效应，用传统的育种方法来实现基因的累加是非常困难甚至是不可能的，利用分子标记技术可以实现有利基因的转移和基因聚合(或基因累加)。无论是基因转移还是基因聚合，因目标性状或目的基因不同，采取的策略及选择的效果会不相同。

(一)利用分子标记技术改良作物的抗性

作物中许多重要的农艺性状，如抗病性、抗虫性、育性、株型等都受主基因的控制，因而常常表现为质量性状遗传的特点，不易受环境的影响，在分离群体中表现为不连续性变异，能够明确分组。近年来，作物质量性状基因定位、克隆取得了重要进展，已经定位并克隆了一批控制抗病、抗虫、育性及株型的重要基因，为开展分子标记辅助选择创造了条件。

在分子标记辅助选择育种中，开始最早、进展最好的是水稻抗白叶枯病基因的转移和基因聚合。水稻白叶枯病是一种重要的细菌性病害，对水稻生产危害十分严重。水稻白叶枯病抗性主要由主效基因控制，到目前已经报道的抗病基因有30多个，其中定位的抗性基因18个，被克隆的基因有8个(Xa21, Xal, Xa26/Xa3, xa5, Xa27, xa13, Xa4,Xa7)。

Xa21是Khush等(1989年)在长药野生稻(Oryza dongistaminata)中鉴定的白叶枯广谱抗性基因，并育成了以IR24为遗传背景的近等基因系‘IRBB21', Song等(1995)克隆了该基因。由于Xa21是最早被克隆的抗病基因，被广泛用于分子标记辅助选择育种。这里简单介绍Chen等(2000)利用分子标记选择将Xa21导入到优良恢复系‘明恢63'的方法。

首先，利用‘IRBB21' /‘明恢63’的F：代群体的200个单株进行基因定位分析，构建了Xa21在11号染色体上的连锁遗传图。然后，利用与Xa21共分离的两个PCR标记("21”和“248")作正向选择，筛选携带，Xa21的单株。在Xa21两侧还找到两个紧密连锁的分子标记C189和AB9，它们距离该基因分别为0.8cM和3.0cM，利用这两个标记选择标记C189或AB9与基因发生重组的单株，从而保证所转移的包含目标基因的外源片段小于3.8cM。

在BC1F1中，通过共分离的分子标记和接种鉴定发现有49株含有Xa21基因，并从中找出一株与AB9侧具有交换的阳性植株。将该单株与‘明恢63’作进一步回交得到BC₂F₁;同样在180个含有Xa21的BC₂F₁中筛选到一株与C189侧有交换的阳性植株，该单株来自‘ IRBB21’含有Xa21的染色体片段应该小于3.8cM。该植株与‘明恢63’进一步回交得到BC₃F₁。选用128个在染色体上分布比较均匀、且在亲本间具有多态性的RFLP标记对250株BC₃F₁、作背景筛选，发现有2株除目标基因位点(RG103)附近区域外，其他位点上的基因型均与‘明恢63’相同。用菲律宾菌系6(其代表生理小种‘Pxo99')接种鉴定这两个单株，它们的抗性反应与‘IRBB21’一样，表现为高抗。将这两株自交，即获得Xa21纯合背景与‘明恢63’完全一致的株系。进一步用多个菌系对它们分别作接种鉴定和农艺性状调查，表明这些株系具有与‘IRBB21’对白枯病病一样的广谱抗性，而农艺性状与‘明恢63’基本一致。

在育种实际中，为了提高育种效率，往往将单个基因转移与基因聚合相结合。例如，国际水稻研究所Huang等(1997)利用4个含有不同水稻白叶枯病抗性基因(xa-4,xa-5,xa-13、xa-21)近等基因系进行抗性基因的聚合，所产生的抗性基因累积的品系比含有单个抗性基因的品系具有更高的抗性水平和对病原菌更广的抗谱。黄廷友等(2003)利用回交携带Xa21和Xa4的‘IRBB60’与‘蜀恢527’回交，将Xa21和Xa4同时聚合于‘蜀恢527'，大大提高了‘蜀恢527’的抗性；邓其明等将Xa21、Xa4, Xa23聚合到‘绵恢725'中；Yoshimura等将Xal , Xa3和Xa4聚合；何光明等(2004)将Xa23和抑制衰老基因IPT聚合；桑茂鹏等(2009)利用分子标记辅助选择，将Xa21和香味基因fgr聚合；易懋升等将细胞质雄性不育恢复基因Rf3和Rf4与4个抗白叶枯基因Xa4, xa5、xa13,Xa21聚合。

稻瘟病是水稻三大病害之一，如何提高抗病育种的效率是育种家面临的难题。到目前，已经定位了50多个稻瘟病主效抗性基因，其中11个抗病基因(Pib, Pita, Pig, Pi2,Pizt, Pid2, Pi36, Pi37, Pikm, Pi5, pi21)被克隆。根据抗病基因定位和克隆的研究结果，利用与抗病基因们紧密连锁的分子标记或根据抗病基因序列开发出功能基因标记进行分子标记辅助选择育种也取得了重要进展。Jia等(2002)利用抗病基因Pi-ta与感病基因pi-ta的序列差异，建立了能特异扩增抗病基因Pi-ta内部序列的显性分子标记YL155/YL87, YL153/YL154, YL100/YL102, Robert等(2004)利用抗稻瘟病基因Pi-b内部特异序列，建立了能特异扩增Pi-b基因内部序列的显性分子标记PibDomo Hittalmani等(2000)同时聚合三个抗稻瘟病主效基因(Pit,YPiz5和Pita)，发现三基因或两基因(均带有Piz5)的抗性比单基因要高。Zheng等将Pil,Pit和Pi4聚合到同一品种中。陈学伟等(2004)将来自不同亲本的抗稻瘟病基因Pid(t), Pib, Pita同时聚合到保持系‘冈46'中。胡杰等(2010)将水稻抗褐飞虱基因Bphl4, Bphl5和抗稻瘟病基因Pit,Pit同时导入到‘珍汕97B’中，发现改良的杂交稻(聚合Bphl4, Bphl5或单基因)的褐飞虱抗性较对照('汕优63')显著提高；穗颈瘟田间自然发病结果也表明：聚合Pit , Pi2的杂交稻发病率仅为约6％，明显低于对照‘汕优63'(约90％);田间农艺性状考察也表明改良型杂交稻的主要农艺性状与对照基本一致，产量高于对照或与对照相仿。

对于质量性状进行分子标记辅助选择技术基本成熟，一般是在回交第一代(BC₁F₁)开始进行前景选择，即目标基因的选择，在随后的回交世代过程中继续对目标基因进行选择。但是，无论是基因转移还是基因聚合，一般还需要进行背景选择。从哪个世代开始背景选择既经济又高效是需要考虑的问题。在低世代开始背景选择，无疑是能够减少后续回交的工作量，但是增加了回交一代的工作量。Chen等(2000)开展水稻抗白叶枯病Xa2l的分子标记辅助选择研究时做出了有益的探索。他们在选择目标基因与两侧标记的重组类型时，从BC₁F_l开始连续选择两个世代进程，每次只选择单侧重组单株，避免了在一个世代获得双交换类型可能所需筛选的大量个体的问题。在BG₃F₁,代进行背景选择，与更低世代(BC₁F_l)进行背景选择相比，分子标记辅助选择的次数减少、工作量减少，提高了分子标记辅助选择的效率。

在实施分子标记辅助选择时，还需要考虑回交次数、群体大小、标记的数目和距离、基因型数据量(marker data point, MDP)。Frisch和Hospital等建立了数学模型模拟这些变量的变化，得出在一个回交世代鉴定目标基因与两侧1 cM标记间发生的双交换需要筛选约94000个单株，而经过两个世代分步检测，则只需要2000株；回复轮回亲本96％的基因组需要40个单株经三个回交世代产生2280个基因型数据，而如果回交两代，则需要200个单株产生的10100个基因型数据。

目前，对回交次数、标记数目和距离、群体大小、基因型数据量的模拟和预测的软件已经被开发出来了。但是需要引起重视的是，连锁累赘取决于目标基因附近的重组频率，而染色体不同位置重组频率变异很大。

(二)利用分子标记技术改良作物的农艺性状

作物多数农艺性状，如产量性状、成熟期、品质、抗旱性等表现数量性状的遗传特点，受多个微效基因控制，用传统育种方法，选择效率低、周期长。近年来，由于分子标记技术的发展，数量性状基因座(QTL)定位及基因克隆取得了长足发展，可将复杂的数量性状进行分解，像研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究，为利用分子标记辅助选择技术对复杂农艺性状进行选择和改良奠定了重要基础。

产量性状是典型的数量性状，对产量性状基因定位、克隆及利用分子标记技术对产量性状的改良一直受到重视。Ashikari等(2005)利用籼稻` Habataki’和粳稻‘Koshihikari'杂交后衍生的96个回交自交系和近等基因系，克隆了位于水稻1号染色体上的穗粒数控制基因Gn1，并利用分子标记辅助选择技术，将控制水稻株高的sd-1基因和增加穗粒数的Gn1基因聚合到优良粳稻品种‘Koshihikali'(越光)中，改良后的‘越光’不仅产量增加，而且能抗倒伏。Xiao等(1996)在马来西亚普通野生稻1号和2号染色体上定位两个主效增产QTL (yld1.1和yid2.1)，邓化冰等(2007)则利用与这两个增产QTL紧密连锁的4个SSR分子标记，通过分子标记辅助选择技术，将两个增产QTL导入超级杂交稻亲本‘9311'一中，发现携带野生稻增产QTL的‘9311'改良系比‘9311’增产，主要表现为有效穗数和每穗总粒数显著增加；携带野生稻增产QTL的稳定株系所配杂交组合也比对照显著增产。

像质量性状一样，复杂性状也采用分子标记辅助轮回选择(marker assisted recurrent selection, MARS)的策略。轮回选择是作物群体改良的有效方法，基本程序为从被改良群体中选株产生后代，对后代进行选择鉴定，优良后代自由授粉，基因充分重组形成新一轮群体。其目的在于为育种家提供改良了的种质，提高育种群体中的有利基因频率。同时，还可以改良外来种质的适应性，拓展和创造新的种质来源。

早期分子标记在轮回选择中的应用，主要集中在基础群体和改良群体遗传多样性的检测，评价轮回选择的效果。刘勋甲等利用RAPD标记检测亲本群体及基础群体和选择一轮后的群体的遗传多样性，发现基础群体的遗传多样性比亲本群体的丰富，选择一轮后的群体保持了群体内广泛的遗传变异；黄素华等用SSR标记的研究表明基础群体遗传变异丰富，经1轮或2轮选择后，群体的多态性位点、基因杂合度、群体内遗传距离和群体间基因型与基因频率都没有显著变化，表明适度轮回选择不会造成群体遗传基础过分变窄，而个体间遗传距离轻微增加，表明个体的某些变异有可能为选择优良自交系提供机会。

利用分子标记技术将多个有利QTL聚合到同一个品种是分子育种的重要内容。如何提高选择效率是面临的难题，通过轮回选择增加有利基因在群体里的频率可望提高选择效率。通常有两种方法，一种是通过自交富集F₂(F₂enrichment)，另一种是通过分子标记辅助进行轮回选择(MARS)。

在F₂代群体中，一个或多个QTL位点的q=qiqi基因型个体被淘汰，余下的个体在所有目标QTL位点都携带有利等位基因(Q_iQ_i 或Q_iqi、基因型)。假如需要改良的性状由10个QTL控制而且又有与之连锁的分子标记，1个单株在1个QTL位点基因型为有利基因型Qq或/-VI)的概率是0.75，如果10个QTL没有连锁，那么10个QTL全部为有利基因型的概率为0. 7510=0.056。换句话说，每18个F₂代单株之中就有一个可以被选择。对每个QTL位点qiqi纯合基因型进行严格的淘汰，每个位点有利等位基因Q的分布频率从0.5增加到0. 67，那么从F2代群体构建的重组自交系中，在所有10个QTL位点基因型都为Q_iQ_i 的概率为0. 67, =0. 018，即55个重组自交系中就有1个系在所有位点都为有利基因纯合。如果不经过F₂代富集，每1024个重组自交系中才有1个在全部10个位点为Q_iQ_i 的基因型。

自交富集F₂代是通过对F₂代群体进行一轮分子标记辅助选择，使每个位点有利等位基因Q_i的分布频率从0.5增加到0.67，从而使所有目标QTL位点都为有利基因型的重组自交系被选择的概率大大增加。但如果目标QTL，数量过多(大于15时)，Q_i分布频率(0.67)仍不足以满足要求。但是MARS通过多轮的分子标记辅助选择克服了自交富集F₂的这个缺点。具体来说，MARS涉及：①鉴定并选择F₂代中在目标QTL含有Q_i数量最多的个体；②被选择的单株自交成家系进行自由授粉，进行再组合；③重复这个过程2次或3次。

由于不同的QTL位点对性状的效应是不同的，MARS方法根据不同标记对表型估计效应的相对大小赋予了不同标记权重，并计算选择系数(selection index)作为选择标准。选择系数的公式为Mi=Σb_iX_ij，其中从是第1个个体的标记值；bi是赋予第i个分子标记的权重；X_ij如果是1，表明第j个个体在第i个标记位点是纯合的有利基因型，如果是-1，表明第j个个体在第i个标记位点是纯合的不利基因型。其中b_i标记权重值可以从表型值对X_ij的多元回归得到。

利用分子标记辅助选择育种已成为植物育种领域的热点。然而，我们应清醒地认识到，分子标记技术只是起辅助作用，辅助选择离不开常规育种。就目前的发展现状而言，利用分子标记辅助选择的理论问题已研究不少，但将分子标记应用于实际的育种项目现在还处于探索阶段，未来的成功还需要不断积累新的经验和知识。