一、原生质体的培养方法

原生质体的培养方法较多，大多数与细胞培养相似。主要的培养方法有三种，即液体浅层培养法、固体培养法、液固结合培养法，不同学者在上述方法的基础上发展了其他的一些方法，如悬滴培养法、看护培养、饲喂层培养等。

(一)液体浅层培养

液体浅层培养(liquid thin layer culture)是目前较常用的原生质体培养方法，一般适用于容易分裂的原生质体。原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中。再取少许在培养皿底部形成很薄的一层，封口进行培养。此法的特点是操作简单，在培养过程中容易添加新的培养液。但其不足是原生质体容易发生粘连，难于定点观察，由于需经常加入新鲜培养基，容易造成污染。此外，与细胞培养相似，原生质体自身释放的有毒物质会影响原生质体的再生。有学者由液体培养方法发展起来另一种较为精细的培养方法，即液滴培养(droplet culture)，其做法是将原生质体悬浮在培养基中，即取少许(如0.1mL)置于培养皿中，每个培养皿放5～7滴。悬滴培养与此类似，只是将培养皿翻转过来的一种培养方法。此法有利于对原生质体的生长和发育进行观察，但原生质体容易聚集于液滴的中央，并且培养基容易蒸发，不利于原生质体的生长。

(二)固体培养

固体培养(solid culture)也称为琼脂糖平板法(agarose bead culture)或包埋培养法(embedding culture)。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂(主要是琼脂或低熔点琼脂糖，LMT agarose)按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。Na-gata和Takebe (1971)首次在烟草叶肉原生质体培养中采用此法，它可以定点跟踪和观察原生质体。由于原生质体被固定在相应的位置，所释放出的有毒物质不易扩散，从而有利于对原生质体再生和发育过程进行详细的观察，减少了原生质体自身释放的有毒物质的影响。所用的凝固剂中琼脂的熔点(45℃)较高，会使原生质体受到高温伤害而影响其生长发育，现在主要是采用低熔点(30℃)琼脂糖作为包埋剂，有研究表明琼脂糖对多种植物原生质体的分裂和再生有促进作用。此外，在有的作物原生质体培养中还用到藻酸盐微珠(alginate bead)、钙-琼脂糖和钙-藻酸盐。

(三)固液双层培养法

固液双层培养法(liquid over solid culture)法结合液体浅层培养和固体培养的优点，在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。

植物原生质体对培养密度较为敏感，一般为10⁵～10⁶个／mL生长比较合适，如果低于10⁴个／mL可能不分裂。为了解决低密度培养的问题，一些学者在双层培养的基础上发展起了饲喂层培养(feeder layer culture)和看护培养(nurse culture)。饲喂层培养是指将原生质体与经射线照射处理不能分裂的同种或不同种原生质体混合后进行包埋培养，或将处理原生质体包埋在固体层，待培养的原生质体在液体层中培养。这种方法培养的原生质体密度可以比正常的密度低。看护培养也称为共培养(co-culture)，是将原生质体与其同种或不同种的植物细胞共同培养以提高其培养效率的一种方法。主要用于低密度原生质体培养、原生质体培养难再生的植物。研究表明，这两种方法可以提高原生质体培养的植板率(plating ef-ficiency，即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比)，其可能的机理是饲喂层细胞或看护细胞为待培养原生质体提供了促进生长的物质，或是吸收了待培养原生质体释放的有毒物质，减轻对它的影响。

二、原生质体培养基

原生质体培养基在很大程度上影响着原生质体再生和其后的分化及器官形成。不同作物的培养基不尽相同，即使同一作物不同基因型用的培养基也可能不同。一般来说，能用于细胞和组织培养的培养基通常只需进行一定的变化即可用于原生质体培养，最常用的培养基是改良MS培养基、B₅培养基和KM_8P培养基等，其他培养基均是在这几种培养基的基础上发展起来的。例如，常用于小麦原生质体培养的培养基有KM_8p, MS, N₆, WPMI等，常用于木本植物原生质体培养的培养基有MS, MT, B₅, DCR, KPR, WPM, K_8p和KM_8P等。表6-3是一些常用的基本培养基及其化学组成。

表6-3一些常用的原生质体基本培养基(Fowke and Constabel, 1985)