一、遗传转化常用的选择标记基因

构建转化载体，不论是利用农杆菌质粒载体的稳定核转化系统，或是通过基因枪利用同源重组的叶绿体转化系统，都需要通过选择标记基因(selection marker gene）使大量非转化细胞在选择压力下无法继续存活，从而富集转化细胞，达到筛选和鉴定转化细胞、组织和转基因植株的最终目的。选择标记基因多遵守下列特性：①一般是不存在于靶标植物细胞中的蛋白质或酶；②基因较小，易于分子克隆；③可以利用表达元件在植物中充分表达；④检测容易，并且能够定量分析。早期转化筛选体系中多用两种选择标记：抗生素选择标记和除草剂选择标记。表9-2为主要常用的选择标记基因。

表9-2主要常用的选择标记基因

与核转化系统相比，适用于叶绿体转化的选择标记基因数目比较少。目前常用的包括aadA基因、nptⅡ基因和aphA基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶，具卡那霉素抗性)。最近ASA2(编码丝氨酸代谢酶)及CAT也表明可以作为质体转化的筛选标记。其中壮观霉素因高度特异性和对植物细胞无副作用成为了质体转化中首选的筛选标记。壮观霉素、链霉素和卡那霉素通过与质体原核类型的70S核糖体特异结合从而阻止蛋白质的合成。最初的质体筛选是利用rrn16基因上的两个点突变而改变核糖体的结构从而阻止抗生素与核糖体的结合达到解毒的目的。之后发现的aadA基因和nptⅡ基因编码的酶可以解毒抗生素，由于其得到的转化效率比利用rrn16的突变基因要高得多，所以现在成为常用的选择标记基因。但遗憾的是单子叶植物水稻对壮观霉素具有一定的天然抗性，所以目前还没有合适的适用于单子叶植物，如水稻、玉米的高效选择标记基因。

二、无选择标记基因转化系统

随着商业化植物转基因品种的不断出现，遗传工程生物可能带来的环境安全和食品安全问题得到了越来越多的关注，是从事转基因研究的工作人员的新的研究热点。选择标记基因的去除，一方面可以解决为了多基因转化过程中面临的可用选择标记有限的问题；另一方面可以减少选择标记给转化植物发育和分化带来的不可避免的代谢负担，另外也避免其在与人类和动物相关的品种上的出现，减少消费者的隐忧。

目前有四大类不同的策略消除选择标记：位点特异性重组系统(site specific recombination system)、直接重复介导的重组系统(direct repeat mediated loop-out recombination system)、共转化与分离系统(co-transformation and segregation system)和转座子系统(transposon system)。

(一)位点特异性重组系统

位点特异性重组是利用重组酶催化两个特定DNA序列的重组，而消除选择标记基因。目前，已经使用的位点特异性重组系统(site-specific recombination system)包括：FLP/FRTs重组系统、Cre/Lox系统和R/RS系统。FRT是重组酶FLP的特异作用位点，Lox位点是重组酶Cre的特异作用位点，RS是重组酶R的识别位点。

来源于P1噬菌体的Cre重组酶为34.1 kDa，由4个亚基组成(2个大的C端亚基和2个小的N端亚基)。C端亚基的结构与λ噬菌体来源的整合酶结构相似，也具有催化位点。Cre可以专一识别由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成的34bp大小的LoxP位点(图9-9)，从而介导2个LoxP位点的重组。LoxP位点的双链DNA被Cre蛋白剪切后再通过DNA连接酶重连，实现DNA的剪切和倒位。在同一染色体上的两个Lox位点如果是反向重复序列，Cre重组酶能介导2个LoxP位点间的序列倒位；如果是同向重复序列，Cre重组酶可以有效切除2个LoxP位点间的序列；如果2个LoxP位点分别位于2条不同的DNA链或染色体上，Cre酶则介导2条DNA链的交换或染色体易位。

图9-9LoxP结构示意图

Dale和Ow首先将该系统利用在转基因植物标记基因去除的研究中。在质体转化系统中，插入到质体基因组中的筛选基因的上下游带有两个同向重复的LoxP位点，带有质体前导肽的Cre重组酶通过核转化在细胞质中表达并进入质体中识别LoxP位点，最终完成筛选标记基因的去除(图9-10)。

图9-10利用Cre/Lox系统消除质体转化标记基因示意图

目前通过农杆菌介导的稳定转化、病毒介导的瞬时转化将Cre重组酶转入转化植株中，或通过杂交的方法导入Cre都已有报道。

(二)直接重复介导的同源重组系统

通过链置换和单链侵入形成异源双链，借助细胞内的重组修复酶可使两条异源DNA链发生交换。该方法是在用选择标记进行筛选并获得转基因植株后，再重新导入一段序列，使标记基因置于两个DNA同源序列之间，通过染色体内重组将含有选择标记的DNA片段去除，获得无选择标记的转基因植株。该技术已较成功地应用于微生物和动物，但在植物中的应用尚处于探索阶段。质体中发生同源重组的频率较高，同向重复序列可以引起序列间DNA的消除，反向重复序列则引起序列间DNA的倒置。可以首先在选择压力条件下得到转化植株，当去掉选择压力后发现筛选标记基因由于同源重组而被去除。目前在植物质体转化系统中，Fischer在衣藻(chlamydomonas)中利用这种特性去除了筛选标记基因；2000年Iamtham和Day也在高等植物烟草中实现了标记基因的去除。

(三)共转化分离系统

共转化系统去除标记基因的原理是将选择标记基因和目的基因分别设计在两个不同的DNA分子上或T-DNA片段中，通过共转化使这两个基因进入植物并整合在基因组中两个非连锁位点上，在植物杂交或自交及减数分裂过程中分离，在后代中获得去除标记基因的转基因植物。运用农杆菌转化将这两种载体(分别含目的基因和标记基因)可以分别导入同一农杆菌菌株，也可以分别导入两种不同类型的菌株混合后进行共转化，一般共转化率可达到50％, McKnight通过改进可达到100％的共转化植株率，在T1代共转化基因出现分离的可能性也约为50％。在基因枪转化中，两个基因共整合在连锁位点上的概率较高，不能有效地获得无标记基因的转基因植株。

1995年共转化法在烟草质体转化中首次得到应用。2003年Ye等通过将两个分别带有壮观霉素抗性的筛选标记基因aadA和抗杀虫剂基因的质粒共转化到烟草质体中，首先通过壮观霉素筛选，在转化植株中的抗杀虫剂含量达到一定量后，再通过杀虫剂筛选，在异质化植株中通过分离，得到了20％的带有抗杀虫剂而不具有选择标记的转基因植株。

(四)转座子系统

转座子是生物细胞中一段特殊的DNA序列，它们可以从同一染色体的一个位点转移到另一个位点，或者是从一条染色体转移到另一条染色体上。研究者利用转座子的流动性可以使带选择标记基因的DNA片段和目的基因分离。目前Ac/Ds系统是研究得比较清楚的一个转座子系统。该系统由自主成员Ac元件编码转座酶用于自身和非自主成员Ds元件的转座。Ds不具备合成转座酶的能力，中间序列可被置换或是插入较大的外源基因，两端的数百个核苷酸是被转座酶识别所必需的元件，所以外源基因能够和自主成员一起被转座酶转移。研究者通过把目的基因置于整个转座子的外部，将选择标记设于非自主成员内部，转化植物后可通过转座作用将选择标记转移，最后通过自交后代中的重组分离得到无标记的转基因后代。但转座子系统效率低，转座子切除有时并不是精确切除，可能会改变周围基因的结构；转座后往往偏向于插入原跳离位点附近区域。需要通过有性繁殖分离目的基因与选择标记基因，周期较长，适用于有性繁殖以及生活周期短的植物。

尽管以上介绍的这些去除筛选标记基因的策略尚不完善，但针对消费者对遗传工程生物的环境安全和食品安全的担忧，利用安全标记和建立无选择标记转基因系统势在必行。相信随着现代生物技术的不断发展，这些系统将会更加完善，适用范围将更加广泛，利于转基因植物的商业化发展。