原生质体融合(protoplast fusion)指不同来源的原生质体自发或在人工操作条件下(适宜的物理条件或化学试剂)融合为一个杂种细胞的过程或方法，也称为细胞融合(cellfusion)、体细胞杂交(somatic hybridization)、超性杂交(parasexual hybridization)或超性融合(parasexual fusion)。原生质体融合不经过有性阶段，超越有性杂交过程和障碍，能够突破物种生殖隔离、克服杂交不亲和、转移数量和多基因性状、创造远缘杂种、扩大遗传变异、创造新异种质资源，为核质互作研究、遗传互补检测、基因定位以及基因组表达模式研究提供良好材料。在表述时用(+)表示体细胞杂交，记为A(+)B，有性杂交则记为A(X)B。植物原生质体融合是基于成熟的原生质体培养技术，包括原生质体分离和纯化、原生质体融合、杂种细胞筛选和培养，杂种植株再生和鉴定等步骤。

一、植物原生质体融合的发展

植物原生质体融合研究落后于动物细胞融合，始于融合方法的探索，然后在多种植物原生质体成熟培养体系上开展原生质体融合研究。1970年，Power首次以硝酸钠为诱导剂进行了原生质体诱导融合；Kao (1974)将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；Zimmermann在1978年采用电脉冲成功地诱导了细胞融合，首次提出了电融合概念，开创了细胞融合技术的新局面；Senda在1979年利用电场刺激实现了植物细胞的融合，并首次实现了电穿孔实验和电刺激植物原生质体融合实验；Schierenberg在1984年首次利用微束激光成功地进行了细胞融合实验，为细胞融合找到了一种新的有效方法；1987年，德国海德堡理化研究所使用准分子激光器泵浦的染料激光器诱导哺乳动物细胞融合和植物原生质体融合。现在基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合研究的重点领域，1987年Schweiger建立了单对原生质体电融合技术。高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片产生的高强度高梯度辐射电场，使细胞融合芯片中的细胞准确地、大批量地得到目标细胞配对和融合，而且可以和传统的化学诱导融合、电诱导融合等相互结合，融合率可大幅度提高。

原生质体培养盛行于20世纪70～80年代，主要在茄科植物，如烟草属(Nicotiana),曼陀罗(Datura)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)和颠茄属(Alro pa )等上获得成功，所以早期的体细胞杂交也集中在这些种属植物间，接着在十字花科芸薹属(Brassica)和拟南芥属(Arabidopsis)以及伞形科胡萝卜属(Daucus)和欧芹属(Petroselinum)等实现了体细胞杂交。随后，一批农作物也开展了原生质体融合研究，如水稻、大豆、小麦、油菜、棉花、谷子、高粱、玉米、马铃薯等的原生质体培养纷纷获得成功，一些木本、观赏园艺和中草药植物的原生质体培养也相继获得再生植株，如在柑橘、称猴桃、樱桃、杨树、榆树、云杉、菊科植物、柴胡和黄芪等上获得了再生植株。

植物原生质体融合最早见Carlson等(1972)在美国科学院院刊上报道的首例粉蓝烟草与郎氏烟草种间体细胞杂种植株再生，随后在植物中得到广泛开展。Power等(1976)在Nature杂志上报道了Petunia h劝rides和P. parodii的体细胞杂交。有意思的是Melchers等(1978)得到了番茄(tomato)与马铃薯(potato)属间体细胞杂种“pomato"，外型倾向于番茄花、叶、果实等具有杂种特点，但是地下部分没有长出希望的马铃薯。自1983年Pelletier等开展十字花科原生质体融合开始，尤其是在芸薹属植物原生质体融合获得大量新异材料开始，已在拟南芥与甘蓝型油菜，白菜与甘蓝，甘蓝型油菜与萝卜、黑芥、芥菜、白芥，芥菜与刺油菜(Brassica spinescens)，以及甘蓝型油菜之间通过原生质体融合获得了再生植株，为油菜遗传和育种提供了珍贵的种质资源。Terada等在1987年将稗草与水稻的原生质体融合，获得了杂种水稻植株，至1999年，已获得17例水稻体细胞杂交组合的杂种植株。Kisaka等(1994)将番茄叶肉细胞原生质体与胡萝卜悬浮培养细胞原生质体经电融合后筛选获得科间杂种。卫志明等(1995)进行野生大豆和栽培大豆体细胞杂交，获得增产和抗病的株系。1995年夏光敏等利用对称和不对称融合获得杂种植株，创建了耐盐、抗旱、高产、优质小麦新种质及新品种，为小麦的种质资源创新做出重要贡献。柑橘是木本植物中最早获得体细胞杂种的树种，Grosser等和邓秀新等开展大量的柑橘等体细胞对称和不对称杂交，得到超过13。例体细胞杂种，并获得抗寒、抗高温和抗病的杂种后代。现已获得木本植物柑橘、梨亚属、李亚属、猕猴桃、樱桃、柿、苹果、杨树、榆树等近100个组合的体细胞杂种植株；也在菊科植物，如向日葵属(Helianthus)、菊属(Dendranthema),莴苣属(Lactuca)等少数几个属，获得近20例属间或种间体细胞杂种；多种观赏植物，如曼陀罗(+)野生曼陀罗、黑心菊(+)金光菊、千里光(+)野生千里光、石竹(+)康乃馨、紫花野菊(+)菊花等得到体细胞杂种。马铃薯野生种具有丰富的抗病、抗虫等基因，但野生种和栽培品种很难进行有性杂交，利用原生质体融合把野生种的抗晚疫病、抗细菌性病害、抗青枯病、抗真菌病、抗虫、抗盐等基因导入到马铃薯品系，得到多个有价值的体细胞杂种。张献龙等2004年以来开展重要经济作物棉花栽培棉和野生棉的体细胞杂种，随后完成近10个种间的原生质体融合。迄今为止，已获得多种植物的种间、属间甚至科间原生质体融合的再生植株近300例。

植物细胞融合可分为体细胞杂交和配子一体细胞杂交(gameto-somatic hybridization),这二者都不经过有性杂交过程，而直接由体细胞或性细胞的原生质体融合产生杂种细胞并再生出植株，能克服有性杂交的不亲和障碍，产生三倍体杂种植株，成为三倍体育种的一条新途径。这里的配子主要指性细胞，没有有性杂交过程，只是用性细胞作为亲本材料，如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等的原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株。

二、植物原生质体融合研究的意义

植物原生质体融合使远缘杂交不亲和的植物有可能实现遗传物质重组，创造和培养植物新品种乃至新物种，尤其在多基因控制农艺性状的改良上具有较大优势。体细胞杂交在转移抗逆性状、进行作物改良、实现远缘重组、创造新型物种以及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子一体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重要的应用前景，并对丰富种质、保持和促进生物多样性具有重大的意义。利用体细胞杂交转移的基因为亲本自身所携带，不存在生物安全性问题。

(一)突破生殖隔离，克服有性杂交不亲和，创造新异体细胞杂种

有性杂交是通过雌雄配子结合，实现双亲遗传物质转移和重组的常规育种手段。不同遗传背景之间的有性杂交可获得比亲本更优良的杂交后代，但是远缘杂交中有性不亲和、双亲花期不遇、雌(雄)不育等阻碍了这一技术在植物育种中的应用。植物体细胞杂交人工诱导使不同亲本原生质体融合，并对异核体培养产生体细胞杂种，可以克服有性杂交遇到的障碍。另外，体细胞杂交相比于传统远缘杂交技术有其无可比拟的优势，种间远缘杂交存在如下几个缺点：一些组合不能进行有性杂交；杂种胚易败育，成活率低；杂种易不育；杂种后代分离过旺；有性杂交向目标亲本导入了有益性状，同时也导入了不良性状，选出仅在某个性状上改善的个体较易，难以兼顾其他农艺性状；由于分离大，需多达8～10年的回交转育，育种周期太长。利用细胞融合将野生种中的优良性状基因向栽培种中转移具有较大的应用潜力，有希望创造出其他方法无法得到的新种质，如常规方法不能实现的远缘杂种和胞质杂种。而且细胞融合转移基因不存在基因安全性问题，因为被转移的基因本身存在于近缘种中。

(二)转移优异的农艺性状，尤其是多基因控制性状和数量性状，创造大量种质资源随着融合技术的发展，使不对称细胞杂交转移目标性状以改良作物的研究成为研究的热点。目前体细胞杂种所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、耐真菌、抗虫、CMS等，其中融合的作物90％以上为双子叶植物。2000年后还增加了耐盐、重金属吸收、药用成分、抗虫、高品质等性状，而且这些体细胞杂交中85％为属间体细胞杂交。尤其是单子叶禾本科，小麦与其多种近缘属间植物进行体细胞杂交，不仅获得再生植株，而且这些新品系和株系存在一些优良的农艺性状，如高品质，耐盐和抗虫等。

Grosse：等(1990)将有性杂交不亲和的非洲樱桃橘与印度酸橘融合，成功地将非洲樱桃橘的抗枯萎病、抗线虫性转移到印度橘中。利用多个柑橘和近缘种的体细胞杂种，进行耐柑橘枯萎病、柑橘裂皮病毒(citrus exocortis virus, CEV)、橘树根枯病病毒、疫霉菌，无籽、三倍体，砧木改良和提高生长势等方面进行改良。在十字花科植物中，Moricandia ar-vensi、是一种介于C3和C4之间的植物，光合能力强，CO₂补偿点低，而且水分利用率高又抗病。Ishikawa等(2003)得到B.oleracea和Moricandia arvensi、的杂种，转入了C₃-C₄中间性状。利用细胞融合获得抗病和细胞质不育材料在作物育种中备受关注。Rasmussen等(1998)通过马铃薯种内二倍体基因型融合，创造了抗马铃薯晚疫病的新种质。Yan等(2004)通过不对称融合把野生稻抗细菌枯萎病性状转移到栽培稻，提高了其的抗病性。通过对称或不对称细胞融合获得了抗病毒、抗线虫、抗真菌病等材料。

(三)选择性转移细胞质基因和基因组，创造胞质杂种，研究核质互作和细胞质基因遗传高等植物的叶绿体和线粒体基因组，多数在有性杂交过程中表现为母性遗传，原生质体融合涉及了双亲的细胞质，相比于有性杂交最大的优势是在转移细胞核基因组同时转移细胞质基因组，这样不仅选择性地进行细胞核基因融合，把细胞质基因转移到全新的核背景中，还可以使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。体细胞杂交时，核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三者均既可以以单亲传递又可以以双亲传递，因而可以产生许多有性杂交难以产生的核一质基因组的新组合类型。胞质杂种具有一个亲本的细胞核和双亲细胞质，是研究胞质基因组的好材料。作物的一些重要经济性状，如胞质雄性不育、抗除草剂基因、抗冻性、C₄等都是由胞质基因控制的，通过原生质体融合进行细胞质基因重组是一条可直接用于育种的简便途径，能够实现胞质基因控制的有益性状的转移，而不育胞质的获得是培育杂种的重要途径。Baldev等(1998)利用Trachystoma ballii与Brassica j uncea融合创造了新型juncea的胞质雄性不育系，新型胞质是双亲胞质重组的结果。飞龙积(Poncirus trifo-liata)与印度酸橘(Citrus reticulata)属间体细胞杂种的线粒体来自后者，而叶绿体则来自前者，是胞质杂合型。原生质体融合产生核质杂种、部分核杂种、部分细胞质杂种、胞质杂种，这些材料是研究细胞质遗传、重组及异源细胞器间互作和协调的良好材料。