植物原生质体融合的发展建立在成熟可靠的融合方法上，体细胞杂交从自然的自发融合发展到将化学试剂诱导、电刺激、微束激光、微矩阵芯片和空间物理场等各种化学和物理技术应用于细胞融合。

一、自发融合

自发融合是指植物组织或细胞在酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象。在1971年Hellmann和Miller等用酶液处理一些植物的组织时观察到多核细胞的出现。用高浓度的细胞壁降解酶处理Lilium longiflorum和Trillium kamtschaticum幼嫩四分体时也观察到了自发融合现象，多核产物获得频率高达90％。在玉米胚乳组织细胞悬浮细胞酶解时，多核融合体出现的频率达50％。

二、化学融合

化学诱导剂能使种或种间以上的各种类型以及各种类型中不同分化程度的细胞原生质体集聚和促进融合，同时还能保持原生质体的活力。早期原生质体融合的方法有NaNO₃法、高pH-高钙法、PEG(聚乙二醇)法，逐渐发展为PEG与高 pH-高钙相结合的方法。常用的诱导剂有NaNO₃、KNO₃、CaCl₂、 PEG、生物素等。这些化学诱导剂具有高效、毒性低、无专一性，广泛用于植物、动物、微生物及它们之间。

(一)NaNO3法

Kuster在1909年观察到用机械法分离洋葱表皮细胞原生质体，低渗NaNO₃溶液能引起发生质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体融合。而后Michel用0. 5mol/L NaNO₃溶液处理薄壁组织和表皮细胞原生质体也产生了同核体(homokaryon)和异核体(heterokaryon)。1970年，Power和Cocking创立了用硝酸钠(0.25mol/L)作为融合剂的诱导融合法，首次使燕麦和玉米的根尖原生质体融合。1972年Carlson等采用此法获得了朗氏烟草与粉蓝烟草体细胞杂种，这是植物中的首例体细胞杂种。此法虽然能够诱导原生质体融合，但其融合频率较低，大约为1％，并且NaNO₃处理对原生质体有一定的毒害作用，现在已基本不用此法。

(二)高pH一高钙法

Keller和Melchers在1973年采用高浓度Ca²⁺溶液处理烟草叶肉原生质体，可以使融合频率较大幅度增加，达到20％～50％。这是由于Ca²⁺能促进两种原生质体的结合，而高pH能改变质膜的表面电荷性质，有利于融合。采用此方法成功地获得了烟草种间和属间体细胞杂种。

(三)聚乙二醇诱导法

1974年高国楠发现聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子质量的PEG时，融合效率较病毒诱导法可提高1000倍以上，PEG在融合过程中起着稳定和诱导凝集作用。后来将其与高pH-高钙法结合使用，大幅度地提高了融合频率，最高可达50％，使用较简便、经济。已有超过100例利用此法获得体细胞杂种植物，它仍是目前最成功的融合技术。聚乙二醇是一种水溶性的高分子多聚体，有带负电荷的醚键，具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连和融合，在高pH-高钙液的处理下，与质膜结合的分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接起来形成具有共同质膜的融合体。它的最大优点是无特异性，甚至动植物界间的界限也可以打破。离子交换树脂纯化PEG, PEG中添加伴刀球蛋白、5％二甲亚砜、链酶蛋白酶都能大大提高融合频率。

(四)多聚化合物法

1975年，Kanega用不同浓度的甘露醇处理烟草原生质体获得了20％以上的融合率；1978年，Nagata用聚乙烯醇(15％) +0. 05mol/L氯化钙+0. 3mol/L甘露醇组成的融合剂，成功地将烟草与大豆、烟草与萝卜等组成原生质体融合。后来又发现许多其他化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，不过以聚乙二醇的效果较好。

三、电场诱导法(细胞电融合)

电场诱导融合主要是双向电泳法，基本流程是原生质体悬浮在低电导率融合液的融合小室中，小室的两极加有高频、不均匀的交流电场，原生质体两极的电场强度不同使其表面电荷偶极化而具有偶极子的性质，从而使原生质体沿电场线运动，相互接触排列成珍珠串。当施加一次或多次直流方波脉冲电场，相接触的原生质体发生可逆性击穿，最终导致融合。整个融合过程大致可以划分为以下几个阶段：原生质体排列、质膜融合、圆球化、核融合(图7-1)。原生质体的生理状态，包括材料的苗龄、形态和部位、组织或细胞的生长状况、栽培条件等对原生质体的分离和活力都有影响；同时制备原生质体酶种类、酶活力和浓度、酶解温度和时间、稳压剂的种类、钙或其他离子的有无与多少、pH也都直接影响原生质体的生理状态和活力，从而影响融合率和融合子活力和再生能力。两亲本原生质体的密度对融合率的影响也很大，密度高的融合率高。

与PEG化学法相比，电场刺激法是一种非常高效的细胞融合方法。电融合技术操作简单、融合率高、重复性强、电参数(如脉冲强弱、长短等)容易精确调节、无化学毒性，对细胞损伤小，可以免去细胞融合后的洗涤程序，可应用于许多种不同的细胞。所以电融合方法在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。

图7-1棉花陆地棉和野生棉电融合过程

四、激光诱导法

1984年Schierenberg首次利用微束激光成功地进行了细胞融合实验，为细胞融合找到了另一种有效的方法。利用准分子激光器诱导哺乳动物细胞融合和植物原生质体融合，从照射到融合仅需几秒钟。细胞之间相互接触是实现细胞融合的前提，可以利用激光的光镊建立两细胞间接触，也就是光镊( optical tweezers)所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现对生物粒子的远距离、非接触式捕获。该法可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小、定时定位性强、损伤小、参数易于控制、操作方便、可利用监控器清晰地观察整个融合过程、实验重复性好、无菌无毒性，但它只能逐一处理细胞。李银妹等于1999年用激光镊(laser tweezer)诱导含叶绿体的烟草原生质体融合。不过激光诱导法中所使用的设备非常昂贵，而且是一种微操作法，对操作技术要求很高，总体来看这种技术的效率并不高。

五、基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统和微加工技术的发展，微电极阵列也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。Stromberg等(2001)在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅度减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

六、高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内(10～40um)产生的高强度高梯度辐射电场，使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的细胞目标；从而使目标细胞按照预先设计的方向以预定的速度(可以使不同种的细胞以不同的速度定向)移动，从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型。集成微电极阵列的微流控系统可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。

七、其他细胞融合技术方法

植物细胞融合过程中由于地球重力的存在，有无液泡的原生质体密度差很大，异源细胞融合率低(Jongkind et al. , 1996)。20世纪80年代以来，在空间材料科学的启发下，利用空间微重力条件改进了细胞融合技术。由离子注入生物效应和粒子沉积生物效应，发展了离子束细胞融合技术。离子束的可操纵性高，可用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的(Liu et al.,2003)。该项技术的成功，改变了传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少了筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。