原生质体的融合方式常见的有两种：对称融合(symmetric f usion)，即两个完整的细胞原生质体融合；非对称融合(asymmetric fusion)，即利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。其中对称融合产生核质双杂合杂种，配子一体细胞融合产生三倍体等；非对称融合又分为核不对称融合和胞质融合，产生非对称杂种、胞质杂种和异质杂种。

总体上对称融合多形成对称杂种，往往是在导入有用基因或优良性状的同时也带入了亲本的全部或部分不利基因或性状；而非对称融合在一定程度上克服了体细胞不亲和性，可以转移部分核基因或者转移胞质基因得到非对称杂种，从融合再生植株中挑选具有优良性状的植株，从而缩短育种时间。早期原生质体融合主要是对称体细胞融合，将两个亲缘关系较远的物种的基因组结合在一起，创造新的植物类型。然而虽得到杂种植株，但其可育性及形态特征趋于不正常化，且双亲染色体出现不可控性排斥与丢失，或者获得的体细胞杂种愈伤组织难以分化。而携带受体全部染色体和供体少数染色体或染色体片段的不对称杂种成为培育新种质的更有价值的材料，因此近年来不对称体细胞杂交已成为原生质体融合的热点。

一、对称融合

对称融合指融合时双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息，而对称融合多形成对称杂种，其结果是在导入有用基因的同时也带入了亲本的全部不利基因，因此需要多次回交才能除去进入杂种中的不利基因，导致育种效率降低。图7-2为典型对称融合的一种再生模型，在获得农艺性状互补的体细胞杂种方面具有一定的优势。

图7-2典型的原生质体对称融合

在融合时，希望体细胞杂种同时拥有双亲的优异性状、同时具有多项功能和性状。但由于它综合双亲的全部性状，在导入有利性状的同时，也不可避免地带入了一些不利性状。尤其在一些远缘组合，融合使双亲的遗传物质均整合到杂种中，由于存在一定程度的体细胞不亲和性，使得杂种植株的表现并不是预期那样理想，最为典型的例子是番茄与马铃薯的体细胞杂种，虽然获得了二者的杂种植株，但并不能得到理想的地上部长番茄地下部结马铃薯的植株，如图7-3所示。远缘的体细胞杂交也受系统进化距离的限制，考虑亲本的系统进化距离、保证双亲能同步分裂是异种原生质体融合的关键，是否能同步分裂与亲缘关系有关，亲缘关系远会发生其中一方染色体被排除和丢失，往往仅保留部分基因组，或一条染色体，甚至全部丢失的现象。

图7-3对称融合获得的理想番茄、马铃薯体细胞杂种

近几年植物配子一体细胞杂交有迅速的发展，因为雄性小孢子原生质体在四分体时较易制备且体细胞原生质体诱导融合。Desprez等(1995)用烟草的成熟花粉原生质体和白花丹烟草体细胞原生质体进行融合得到了杂种植株。配子-体细胞杂交的成功克服了有性杂交的不亲和障碍，产生了三倍体杂种植株，成为三倍体育种的一条新途径。

二、非对称融合

非对称融合是指一方亲本(受体)的全部原生质与另一方亲本(供体)的部分核物质或胞质物质重组，产生不对称杂种，即“供体-受体”系统。不对称杂种较对称杂种来说，至少亲本一方有部分染色体被消除；较胞质杂种来说，即使亲本一方染色体全部消除，仍保留着该亲本的某些核基因控制的性状。因为不对称融合只有供体的少量染色体转入受体细胞，更有希望克服远缘杂交的不亲和性，并且得到的杂种植株拥有实际所要求的性状，减少回交次数甚至免去这一步骤便能达到改良作物的月的，使育种周期大大缩短。非对称融合需要在融合前对一方原生质体(供体)给予一定的处理，如使用纺锤体毒素、染色体浓缩剂、γ射线、x射线、紫外线等，使其细胞核染色体部分破坏，细胞不能生长；对另一方原生质体(受体)用化学试剂进行处理，一般用碘乙酰胺(IOA)或碘乙酸(iodoacetate, IA), IA和IOA都可以与磷酸甘油醛脱氢酶上的一SH发生不可逆的结合，抑制酶的活性，从而阻止3-磷酸甘油醛氧化生成3-磷酸甘油酸，使糖酵解不能进行。罗丹明(rhodamine-6-G, R-6-G)是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而导致线粒体失活，从而使其细胞失活，单独培养不能生长和分裂，用于体细胞杂交，只有融合体发生互补作用才能生长，从而挑出杂种。所以说不对称融合也是一种筛选杂种细胞的方法，用此法已创造和筛选出很多体细胞杂种，主要有豆科、禾本科、茄科、十字花科、芸香科、伞形花科、旋花科和棉属等科。

(一)原生质体供体处理

供体细胞核失活常用的方法是融合前利用X射线、γ射线或紫外线(UV)辐射，或限制性内切核酸酶、纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体。一般染色体丢失与辐射剂量之间呈正相关并且与很多因素，如基因型、辐射源、辐射剂量、融合亲本亲缘关系的远近、亲本和融合产物的倍性、培养条件等有关。对供体进行处理主要是造成染色体的断裂和片段化，从而使供体染色体进入到受体后部分或全部丢失，达到转移部分遗传物质或只转移细胞质的目的。此外，当供体原生质体受到的辐射剂量达到一定值时，不能分裂，也就不能再生细胞团，从而能够减少再生后代的筛选工作。Gleba等(1988)利用γ-融合得到烟草和颠茄属间不对称杂种。Vlahova等(1997)用UV辐射番茄原生质体，再和兰雪叶烟草(N. plumbagini folic)原生质体融合，得到高度非对称且部分可育的杂种。杨细燕和张献龙(2007)获得未处理的陆地棉和W处理的野生棉(G. klozschianum)不对称杂种。

(二)原生质体受体处理

为了减少融合后代的筛选工作，利用一些代谢抑制剂处理受体原生质体以抑制其分裂。常用的抑制剂有IA, IOA和R-6-G。受IA, R-6-G和IOA处理的细胞和末受代谢抑制剂处理的细胞或核钝化的细胞发生融合后，代谢上就会得到互补，从而能够正常地生长。而代谢抑制剂处理的原生质体在培养过程中不能分裂，有的原生质体慢慢地变形，最终破裂。

(三)“供体一受体”系统

原生质体“供体一受体”融合是目前最为可行的方法，由Zelcer等(1987)提出，其原理基于生理代谢互补，利用高于致死剂量的电离辐射处理供体原生质体使其核裂解或完全失活，细胞质完整无损；再用IA或IOA处理受体原生质体以使其受到暂时抑制而不分裂，这样双亲原生质体融合后只有融合体能够实现代谢上的补偿，进行持续分裂，形成愈伤组织或再生植株，这些融合体产生各种核质组合的胞质杂种。此技术的优点是双亲不需任何选择标记，适用范围广、可行性强；缺点是难以掌握适宜的辐射剂量。付莉莉和张献龙(2009)等把陆地棉原生质体经过0.5mmol/L IOA室温下处理20min，野生棉原生质体经过38.7J/cm²的UV处理30s得到的大部分再生植株表现出新形态，部分表现亲本中间型，少数偏向受体亲本的种间体细胞杂种。

(四)“胞质体一原生质体”融合法

所谓胞质体是指去核后的原生质体，利用胞质体进行原生质体融合可以得到胞质杂种，实现细胞器的转移，避免了电离辐射可能产生的不利影响；缺点是制备胞质体比较困难。现在获得胞质体的方法：一是采用细胞松弛素B处理；一是采用Percoll等渗密度梯度超速离心。由于细胞松弛素B对细胞有一定的毒害作用，现在分离胞质体普遍采用等渗密度梯度超速离心方法。

由于胞质体是只具有细胞质而不含核物质的小体，因而被认为是最为理想的胞质因子供体，“胞质体一原生质体”融合也就被认为是获得胞质杂种、转移胞质因子最为有效的方法。Maliga等(1982)从普通烟草突变体中分离胞质体，与N. plumbagini folic原生质体融合，获得了胞质杂种，实现了胞质因子控制的抗链霉素特性的种间转移，这是开花植物中第一例胞质杂种报道。迄今为止，已通过“胞质体-原生质体”融合获得了烟草(＋)烟草、萝卜(＋)烟草、萝卜(+)油菜、大白菜(+)花椰菜等组合的胞质杂种，均有效地实现了胞质因子的转移。

与非对称融合相比，胞质体-原生质体融合更能有效地转移细胞质基因组控制的农艺性状，如细胞质雄性不育(CMS)，胞质体通常只具有CMS供体的胞质，而不具有核物质，在胞质杂种中CMS供体核的干扰就降到了最低。Sakai和Imamura (1990)分离萝卜CMS系胞质体，成功地将CMS从萝卜转到油菜中，获得新的CMS型油菜。Spangenberg等(1990)通过1对1微融合将含有N. bigelovii雄性不育的普通烟草胞质体与雄性可育烟草原生质体融合，实现了烟草品种间CMS的转移。Sigareva和Earle (1997)将抗寒的Ogura型CMS特性的花椰菜胞质体与大白菜原生质体融合，获得了抗寒的、胞质雄性不育的大白菜，实现了胞质因子的转移，相比传统回交方法缩短了时间、加快了育种进程。

(五)亚原生质体-原生质体融合

亚原生质体主要有小原生质体(miniprotoplast，具备完整细胞核但只含部分细胞质)、胞质体(cytoplast，无细胞核，只有细胞质)和微小原生质体(microprotoplast，只有1条或几条染色体的原生质体)三种类型，其中用得多的是胞质体和微小原生质体。微小原生质体主要采用化学药剂处理结合高速离心获得，微小原生质体与原生质体融合能得到高度非对称杂种。Ramulu等(1996)将转基因马铃薯植株的微小原生质体与番茄原生质体融合，得到的再生植株均只含有供体1条染色体，但具有受体全部的染色体。Louzada (2007)通过柑橘微小原生质体与原生质体融合，获得只含有19条(微小原生质体提供1条染色体)和22条(微小原生质体提供4条染色体)的杂种植株。这种融合对于转移少量核物质、降低体细胞不亲和性具有一定的意义。

(六)自发形成的不对称性杂种

自发形成的不对称性杂种是指远缘种间诱导融合后由于离体培养过程中发生了两个亲本或一个亲本的基因组部分丢失而形成不对称的组合。因此，对称融合和非对称融合再生的体细胞杂种均能够获得对称杂种、非对称杂种和胞质杂种三种情况。拟南芥(+)油菜、曼陀罗(+)颠茄及烟草(+)天仙子等原生质体融合所得的体细胞杂种在器官分化前有机会发生一定程度的不对称化。另外，由于亲缘关系较远，杂种细胞及其克隆在离体培养或继代选育中常常发生某一亲本的染色体部分丢失以至全部丢失，最后形成了只有一个亲本的核基因组和双亲的胞质基因组，有的只能停留在杂种愈伤组织，不能分化得到再生植株，或得到的再生植株而不育，这些就是自发形成的不对称细胞杂种。Puppilli等(1995)用四倍体苜蓿(2n=4x=32)和二倍体野生苜蓿(2n=2x=16)经原生质体诱导融合得到细胞杂种(2n=4x=48)。虽然细胞杂种中有双亲的染色体，但通过RFLP分析，野生苜蓿的染色体组并未完全整合到融合产物中，多次杂交的后代双亲的染色体组是按孟德尔定律分离的。细胞杂种群体中染色体有不正常现象，常出现单价和迟滞现象。