一、体细胞杂种的筛选

如何从细胞融合产物中筛选出杂种细胞是体细胞杂交成功的另一关键技术。目前融合方法主要是以群体融合为主，还很难实验一对一融合得到异核子，所以在原生质体融合后的群体中可形成各种遗传组分的异源或同源融合体。没有杂种选择技术常不能获得有效的体细胞杂种，而缺乏有效的具普遍意义的选择系统，正是制约体细胞杂交发展的瓶颈之一。杂种选择通常采用互补选择法，以遗传标记、细胞对营养反应差异以及生化特性表现差异为基础，既可利用自然存在的遗传、细胞、生理、生化上的不同作为标记，也可利用人工诱变的突变体，如抗药性、对生态条件下的敏感反应、叶绿体缺失、营养缺陷等巧妙地组成互补选择体系，构成一次性或多级性选择的程序。

(一)机械选择法

利用双亲原生质体的形态特征判断异核细胞，但准确度不高，主要利用融合亲本的物理特性差异进行筛选。例如，在叶肉原生质体和愈伤组织原生质体融合中前者含有叶绿体呈绿色，后者含有很多淀粉粒和浓厚的细胞质，在倒置显微镜下可以根据颜色将融合子挑选出来。例如，棉花野生棉幼胚原生质体和胚性愈伤组织原生质体的融合产物、异核子(图7-4A)、幼胚原生质体融合子(图7-4B)、愈伤组织原生质体融合子(图7-4C)，在显微镜下很容易辨认出。但形态选择方法效率较低，局限性大，必须采用形态特征不同的材料作为融合亲本。

图7-4棉花野生棉幼胚原生质体和陆地棉愈伤组织原生质体各种组合的融合子

除了原生质体自身颜色可作为筛选外，也可以利用荧光剂标记没有形态和颜色差异的原生质体，即荧光激活细胞分拣术(fluorescence activated cell sorting, FACS)进行选择，此法基于原生质体由不同荧光染料造成染色不同，如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocya-nate, FITC)和异硫氰酸罗丹明(rhodamine isothiocyanate, RITC)标记双亲原生质体，二者可以使细胞核发出不同颜色的荧光，从而在流式细胞仪中将杂种细胞区分开来，此法已成功地用于FITC和RITC标记的烟草叶肉原生质体，在白菜型油菜与花椰菜等组合的体细胞杂种筛选中分拣出来的细胞80％为体细胞杂种。图7-4D为采用FITC和RITC标记的烟草叶肉原生质体，前者使原生质体发出绿色荧光，后者使原生质体发出红色荧光，当加入PEG诱导融合后，发出黄色荧光的即为杂种细胞。

(二)遗传互补选择法

利用植物突变体间在生理和遗传上的互补选择杂种细胞及其愈伤组织，或利用一个亲本功能正常等位基因纠正另一个亲本的缺陷，让杂种细胞表现正常已应用在烟草种间、矮牵牛种间、曼陀罗属间、胡萝卜(+)羊角芹属间、苔藓种间原生质体融合中，所用的生理和遗传特性有生长互补、营养缺陷型互补、抗性互补、雄性不育与雄性可育型互补、白化突变与野生型互补、非等位基因互补等。

隐性非等位基因互补筛选法也可以用于体细胞杂种的筛选，如S烟草和V烟草是两个光敏突变体，由不同的隐性非等位基因控制，二者在正常光照下生长慢，且再生的突变体愈伤组织为淡黄色，其原生质体融合产物再生的愈伤组织在强光照下为绿色，表明为杂种。采用隐性非等位基因互补法还筛选出了烟草种间、洋金花种内、矮牵牛(+)拟矮牵牛的体细胞杂种。Gleba (1988)研究蓝茉莉叶烟草与颠茄不对称体细胞杂交时，利用代谢突变体为材料，受体为硝酸还原酶缺失突变体，依据硝酸还原酶的补偿性选择杂种。夏光敏等(1995; 1999; 2001)利用融合产物的再生能力互补来选择杂种，即受体和供体愈伤组织都经过多年的继代，或供体经高剂量辐照后失去再生能力，但融合产物具有再生完整植株的能力，从而获得杂种植株，在小麦与簇毛麦、高冰草、新麦草的不对称融合中再次观察到了这种现象。这种互补再生的现象或许能为建立具有普遍意义的选择体系提供了一条新的途径。不对称体细胞杂交也提供了一种选择方法。一般受体细胞质失活，单独培养不能生长和分裂，而供体受到射线辐照，大部分染色体受到损伤，细胞不能生长，只有融合体发生互补作用才能生长，从而挑选出杂种，用此种方法进行筛选已有很多成功的例子。

利用对抗生素的抗性互补性差异可以筛选体细胞杂种。将抗性材料分离原生质体，与不抗该抗生素的材料(大多数情况下伴随具有再生能力)融合，通过抗生素抗性和再生能力互补即可筛选出体细胞杂种。Samoylov和Sink (1996)在进行番茄与茄子不对称体细胞杂交时，供体为卡那霉素转化系，但辐射使之钝化，不能分裂，而受体对卡那霉素敏感，只有具有受体全套基因组和供体抗卡那霉素基因杂种才能在含卡那霉素的培养基上生长。Sproule等(1991)利用双抗抗生素基因系统筛选烟草间的体细胞杂种。Kaendler等(1996)采用二倍体Solanum papita转ro1C基因系，能够抗卡那霉素，但分离出的原生质体不能发育再生出植株，另外一个融合亲本S.tuberosum原生质体具有再生能力，但在卡那霉素的培养基中不能生长。二者原生质体融合后，培养在加有卡那霉素的培养基中，只有杂种细胞能够生长并再生出植株。

二、体细胞杂种的鉴定

植物原生质体融合后，如果两个融合亲本的原生质体均具有再生能力，理论上融合后再生植株具有以下几种可能性，亲本原生质体的再生体、亲本原生质体融合后的再生体、体细胞杂种(异源二核和多核杂种)。因此，在融合再生植株中既有亲本类型植株，也有体细胞杂种，因而只有进行鉴定才能确定是否是真的体细胞杂种。用来鉴定体细胞杂种的方法除形态学(花的颜色、形态、叶子的形态和大小等)比较、细胞学观察(染色体、叶绿体数目、形态和DNA含量等)和生化分析(同工酶和次生代谢产物等)外，最直接的杂种证据来自于分子生物学鉴定。目前，用于体细胞杂种鉴定的分子生物学方法有RFLP, RAPD,SRAP, SSR, AFLP, Southern杂交、原位杂交等。

(一)形态学

形态学比较是最基本的鉴定方法，观察的内容主要有叶片、花的颜色、植株生长习性等形态性状。一般情况下，对于亲缘关系相近的种，融合再生植株的形态介于融合双亲之间或偏向一方亲本，如普通烟草和粉蓝烟草的种间体细胞杂种在叶片形态、表皮毛状体的密度、花的结构和颜色均介于二者之间。粗柠檬和哈姆林甜橙的体细胞杂种花的颜色体现两者的特征。远缘体细胞杂种，尤其是有性杂交不亲和的组合，杂种形态变化较多，有亲本形、居中、变异形等几种。由于形态学特征易受环境条件的影响，同时原生质体培养过程中的体细胞无性系变异也会造成形态的改变，因此，形态学鉴定只是初步的结果。

(二)细胞学

染色体数目和形态具有种属特异性，是鉴定杂种的细胞学主要证据，主要观察染色体的核型、染色体形态差异和进行染色体计数。如果融合亲本在染色体形态上差别较大，则通过细胞学方法较易将体细胞杂种鉴别开。例如，水稻染色体小，而大麦染色体大，二者融合后，从染色体大小上很容易将体细胞杂种鉴别出来。但有的植物染色体差别不大，则染色体核型和差异分析难以比较。就数量而言，在对称融合中，体细胞杂种染色体数量一般为双亲之和，但也有例外。例如，在韭菜和洋葱、柑橘和澳洲指橘的对称融合后代中，体细胞杂种染色体数均比双亲之和少。传统的染色体观察法为染色法(苏木精染色或洋红染色)，但现在分析体细胞杂种倍性的一种快速且简单的方法是采用流式细胞仪(flow cytometer)进行分析。

(三)遗传标记

早期鉴定植物体细胞杂种最有效的方法可能是同工酶。利用同工酶鉴定体细胞杂种表现在两方面，一方面是分析其活性，另一方面是分析再生材料是否具有双亲的同工酶位点。同工酶鉴定体细胞杂种已经用于茄属、烟草、柑橘、苜蓿、胡萝卜等作物中，用于鉴定体细胞杂种的同工酶有莽草酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、过氧化物酶、天冬酰胺氨基酸转移酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸转氨酶、乙醇脱氢酶、细胞色素氧化酶、脂酶、淀粉酶等。但同工酶的表现会受到植物生长阶段和发育时期的影响，因此在进行同工酶分析时，要使用处于同一发育阶段的植物组织。

分子标记直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各个发育时期均可以检测到，不受季节和环境的限制，并且数量多、多态性高，已经逐渐用于植物体细胞杂种的鉴定。用于植物体细胞杂种鉴定的分子标记有RAPD, RFLP,AFLP, SSR和ISSR，细胞质基因组CAPS和叶绿体SSR。

采用同工酶和分子标记鉴定体细胞杂种，如果再生植株的带型为双亲之和，或在再生植株中均具有双亲的特异带，可以肯定该植株为体细胞杂种。但是，在有些分子标记的带型图中再生植株只具有融合亲本一方的特异带，而不具有另一个亲本的特异带，此时，不能肯定是否为体细胞杂种，必须进行更多的分析，以确定是否存在第二个融合亲本的特异带。此外，在分子标记带型图中经常观察到出现新带型，同时也可以观察到带的丢失(图7-5 )。对mtDNA和cpDNA的鉴定，主要通过直接分离出cpDNA和mtDNA进行RFLP, PCR-RFLP分析或进一步用种特异基因序列作探针进行Southern杂交分析，或者用叶绿体及线粒体特异重复序列探针或非特异重复序列探针对杂种总基因组进行RFLP分析和Southern杂交分析。此外，还可以通过纯化的cpDNA, mtDNA获得的限制性图谱分析鉴定叶绿体和线粒体。

图7-5RAPD和SSR鉴定陆地棉和野生棉体细胞杂种的照片(付莉莉等，2009)

M.分子标记；Y.陆地棉；D.野生棉；1～10.体细胞杂种

(四)原位杂交技术

染色体原位杂交技术(chromosome in situ hybridization, CISH)、荧光原位杂交(flu-orescence in situ hybridization, FISH)和基因组原位杂交(genome in situ hybridization,GISH)近年已经广泛应用于植物遗传育种实践，在植物体细胞杂种遗传鉴定方面也显示出其优势，FISH使信号检出率成倍提高，GISH技术更直接简便，可与整条染色体杂交，而且杂交位点可以在细胞分裂任何时期观察到，所以已经成为鉴定供体染色体及染色体片段最为有效而直观的方法。番茄与马铃薯二倍体细胞间融合再生了四倍体和六倍体植株，对其中的4个四倍体和4个六倍体进行GISH分析表明，4个四倍体的染色体均等地来自双亲，而4个六倍体杂种的染色体中，一套来自番茄，另一套来自马铃薯(Escalante et al. , 1998，彩图1)

(五)蛋白质和蛋白质组学在体细胞杂种鉴定中的应用

采用等电点聚焦进行分析，可以分析融合植株的叶绿体和核的基因组遗传情况，此法也已成功地用于番茄、烟草种间杂种分析，番茄与马铃薯属间体细胞杂种也是采用此法进行鉴定的。刘恒和夏光敏对普通小麦‘济南177’与高冰草不对称体细胞杂种后代F₅～F₈代进行高分子质量麦谷蛋白亚基的遗传、育种及基因分析，发现杂种后代中除具有亲本小麦及高冰草的高分子质量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)或组合外，还具有不同于亲本小麦的HMW-GS亚基及组合。