菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志，具有重要卫生学意义，被国外广泛应用于食品卫生工作中。菌落总数作为卫生检验指标芸的常检项目之一，国家标准检测方法检测程序比较繁琐，倾注平板时受温度影响较大，影响检测结果。因此，发展快速、简便、经济的检测方法势在必行，最主要的是缩短检测时间，提高检出率，方便生产在线检测和现场检测等。

茵落总数——样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1mL(g)检样或单位面积样品巾所含菌落的总数

[检测原理]

Petriflm^TM细菌总数测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有标准的培养基，冷水可溶性的凝胶剂和氯化三苯四氮唑(OTC)指示剂，菌落在测试片上呈红色或粉红色，这样可增强菌落计数效果。

[设备和材料]

恒温箱：(36±1)℃，(30±1)℃；

冰箱：2~5℃；

pH计或精密pH试纸；

放大镜或菌落计数器。

[培养基和试剂]

(1)1mol/L氢氧化钠(NaOH)称取40gNaOH溶于1000mL蒸馏水中。

(2)1mol/L盐酸(HCI)移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。

(3)细菌总数测试片、压板和快速涂抹棒等。

[检测程序]

见图1-1。

图1-1菌落总数的检验程序

(1)样品制备以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

固体或半固体食品：以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1~2min，制成1：10样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。

干燥或干粉食品：以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂和适量玻璃珠的500mL稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：10的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次，也可用机械振荡器振荡15s代替手摇。

液体食品：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，按干燥或干粉食品方法迅速振摇，制成1：10的样品匀液。吸取样品时，吸管插入液面下不要超过2.5cm。吸管内液体要在2~4s内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。

(2)稀释样品匀液用10mL灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10mL，放入装有90mL稀释剂的200mL稀释瓶中，迅速振摇，制成1：100的样品液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。

分别用10mL灭菌吸管按上述方法将样品匀液制成10倍递增稀释的样品液，如10^-3、10^-4、10^-5......。

(3)接种选择2~3个适宜稀释度检验。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜，用吸管或微量洗液器吸取某一稀释度的1mL样液，垂直滴加在测试片的中央处，将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜，将压板(凹面底朝下)放置在上层膜中央处，轻轻压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，拿起压板，静置至少1min以使培养基凝固。每个稀释度接种两张测试片，每张1mL。

(4)培养将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，可堆叠至20片，36±1℃条件下培养48±2h(水产品30±1℃培养72±3h)；

(5)菌落计数和记录计数红色菌落。到培养时间后应立即计数，如果不能立即进行计数，可以将测试片放在-15℃条件以下，但不超过7d。

[结果判定]

培养后，立即计数每个测试片上的菌落数。25~250个菌落为合适范围。

如只有一个稀释度的两个测试片上的菌落在合适范围内，先计算两个测试片的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)样品中测试片菌落数(表1-1，样品1)。

如有两个稀释度在合适范围内，先计算每个稀释度两个测试片的平均值，再计算两个稀释度的平均值，然后计算每克(毫升)样品中测试片菌落数(表1-1，样品2)。当最低稀释度的两个测试片上都少于25个菌落时，计数这一稀释度两个测试片上的实际菌落数，计算两个测试片上的平均菌落数，将平均菌落数乘以稀释倍数，得到估计的测试片菌落数。给这个数注上星号(*)，表明该数系从菌落数在25~250这一范围之外的测试片估计所得(表1-1，样品3)。

当所有测试片上的菌落都超过250时，则应将最高稀释度的两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数，得到估计的测试片菌落数。给这个数注上星号(*)表明该数系从菌落数在25~250这一范围之外的测试片估计所得(表1-1，样品4)。如果所有稀释度的测试片都没有菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数报告测试片菌落数。给这个数注上星号(*)表明该数系从菌落数在25~250这一范围之外的测试片估计所得(表1-1，样品5)。同一稀释度的两个测试片中，一个有25~250个菌落，另一个的菌落多于250个，两个测试片都要计数。先计算两个测试片的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)样品中测试片菌落数(表1-1，样品6)。两个连续稀释度中的每个稀释度都有一个测试片的菌落数在25~250个范围内，而另一个的菌落数高于250或低于25，四个测试片都要计数，先计算每个稀释度两个测试片的平均值，再计算两个稀释度的平均值，然后计算每克(毫升)样品中测试片菌落数(表1-1，样品7)。某稀释度的两个测试片都有25~250个菌落，而另一稀释度的两个测试片中只有一个测试片的菌落数在25~250范围内。四个测试片都要计数，先计算每个稀释度两个测试片的平均值，再计算两个稀释度的平均值，然后计算每克(毫升)样品中测试片菌落数(表1-1，样品8)。记录时，只有在换算到每克(毫升)样品中测试片菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的测试片菌落数记录为10的指数形式(见表1-1，括号中的例子)。

表1-1平板菌落数计算菌落数

注：带星号(*)者为估计数。

[说明]

使用过的纸片上带有活菌，需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理。

相关链接：食源性微生物快速检测研究现状（三）

文章来源：《食品快速检测实训教程》

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