［检测意义］

肉制品市场中,一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉冒充猪肉，以猪肉冒充牛羊肉等,用低价劣质的肉冒充高价优质的肉,极大地损坏了消费者的利益和健康。目前,质监部门主要是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别工作,这些传统鉴别方法对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用。但是,对于很多熟肉制品(如香肠)来说,加入的肉经过了粉碎处理,并且添加香料掩盖了原有的味道,传统的方法难以进行准确地肉类来源鉴定。

目前,市场上经过加工的熟肉制品质量难以鉴定，国家及地方各级质监部门急需一种分析食品中的肉类来源的方法能够快速、有效地对肉类来源进行检测。分析食品中的肉类来源的方法主要有两种:应用抗体特异性的ELISA法和基于核酸特异性的PCR法。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性， 导致ELISA法鉴定肉类来源的稳定性和可靠性较差。而在食品加工过程中， 部分DNA不会被破坏， 所以利用PCR方法检测食物中肉类成分是切实可行的方法， 该法可以不受肉类高温加工的影响。另外， PCR法具有特异性强、操作简单、灵敏度高的特点， 建立的方法成本低，易于快速推广。

基于PCR方法检测饲料和生肉制品中的肉类来源已经得到了较多的关注和研究。2000年， Montiel-Sosa JF等建立了基于PCR技术的检测肉制品来源的方法， 主要用来检测食品中是否有猪肉或猪油。2007年， Tanabe S等采用定量PCR的方法分析食物中猪、鸡、牛、羊及马肉来源，并且可以实现较为准确的定量。通过对市场上的一些熟肉制品进行随机检测，了解市场上熟肉制品的来源情况。

[采样地点]

超市、正规熟食店、小摊贩。

[实验试剂与材料]

核酸抽提试剂盒、DNA marker、溴化乙锭(EB) 染色液、Tap DNA酶、PCR试剂盒等。

猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、火腿肠、香肠等。

[实验方法]

(1) 样品中DNA的提取将所有样品用液氮充分研磨备用，首先取10~20mg样品用200uL TE缓冲液悬浮， 加入400uL裂解液(5mol/L CuSCN； 0.05mol/L Tris―HCl， pH为6.4； 0.02mol/LED TA， pH为8.0； 1.3%Triton X-100) ， 70℃温浴10min， 然后加等量氯仿混匀， 离心(10000r/min， 5min) ， 取上层水相， 接着加等量冰乙醇-20℃沉淀10min， 离心(10000r/min， 5min) ， 弃去上层清渍， 再用70%乙醇洗涤一次， 晾干， 最后用50uLTE溶解沉淀。-20℃下保存待用。另外，也可以采用染色体DNA提取试剂盒来提取样品的全部DNA。

(2) PCR试验将设计好的引物分别与提取到的熟猪肉、熟牛肉、熟羊肉、熟鸡肉DNA进行PCR扩增反应， 并对产物进行检测(见表5-1) 。

表5-1 不同种属动物的引物

以牛肉DNA与各引物的反应为例。首先取等量牛DNA加入到4个100uL无菌PCR管中， 然后分别加入牛引物、猪引物、鸡引物和羊引物(正向和反向引物均相等) ， 接着在每个PCR管中加入适量含TapDNA酶， dNTPs等的2x master， 再加入尤菌双蒸水稀释， 最后将反应体系放入PCR仪中， 设定不同的变性、退火和延伸时间和温度(见表5-2)。

表5-2 PCR检测方法的循环参数

(3)电泳分析 由于引物、模板及反应体系的不同， 在具体PCR过程中， 循环参数会有轻微的波动。反应完毕后将PCR产物取出， 利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

文章来源：《食品快速检测实训教程》

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