一 超临界流体和超临界流体色谱

超临界流体色谱（supercriticalfluidchromatography,SFC）是以超临界流体（supercriticalfluid,SF）为流动相的色谱技术。众所周知，在常温下物质可能存在三种聚集状态，即气体、液体和固体。在较低的温度下，增加气体压力时气体会转化成液体；当温度升高时，液体体积增大或转化为气体，某些纯物质存在三相点和临界点，二氧化碳的典型相图。在三相点下，气、固、液处在平衡状态，存在一个临界温度Te和临界压力pe。在高于Te时，无论施加多大压力，物质也不会液化，即pe,Te以上或临界点以上条件下，物质不会成为液体或气体，物质聚集状态为介于气体和液体之间的流体，这种流体称为超临界流体，物质临界点温度通常高于沸点和三相点。

超临界流体对分离具有极有价值的独特物理化学性质，这些性质介于气体和液体性质之间。随温度、压力的升降，其密度等性质会变化。

早在1869年，Andrews就发现超临界现象。1879年HannayJB首次报导了超临界乙醇溶解金属卤化物。1943年发展出一种新的分离方法—超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction,SFE)，其后提出利用超临界流体密度改变对组分进行选择性萃取的观点。1962年KlesperE首次报导了以超临界二氟二氯甲烷和二氟一氯甲烷为流动相法，分离镍卟啉异构体的超临界流体色谱法。SieST和Giddings在这一时期进行了SFC分离高分子物质的大量研究，显示这种技术的应用前景。由于SFC涉及实验技术上一些困难，其发展缓慢。

1981年NovotnyM和LeeML首次报导了毛细管超临界色谱技术，进而对SFC的理论、技术作了系统研究。1986年美国的Lee科学公司推出第一台商品化SFC仪。此后十多年，SFC获得迅速发展，形成一个SFC浪潮，以致有人认为SFC会掀起分离分析方法的革命。

从热力学上看，超临界流体的密度是气体的100-1000倍，和液体相近，具有和液体相似的溶解能力及与溶质的作用力。而从动力学上看，SF的黏度比液体低，可以使用比液相色谱更大的线速度；扩散系数是液体的10-100倍，传质速率高，因而可以获得比HPLC有更高的拄效和更快的分析速度。SFC可选用GC和HPLC的检测器，与MS,FTIR等联用也比较方便，从而使其在定性定量方面有较大的选择范围。从理论上讲，SFC可分析不适用于GC高沸点、低挥发性试样和HPLC中缺少检测功能团的试样，约占色谱分离中25％的化合物。但SFC的发展并不如人们预料的乐观，20世纪90年代后期，SFC研究报告逐渐减少，其应用还是有限的，未发展成为像GC和HPLC一样的常规分离分雄家法“一些大公司纷纷放弃进一步发展SFC的计划，SEC发展趋向低落。

SFC发展的大起大落，究其原因主要有两方面：一是分离科学发展的大环境。20世纪90年代，毛细管电泳的出现和发展，它提供了大量有价值的分析结果，而仪器设备和技术比需要高压、高温的SFC简单和容易得多，从而吸引大量分离科学工作者进人这个新领域。第二个，也是更重要的原因是超临界流体自身物理性质带来SFC方法局限性，这是人们在SFC爱接初期认识不足的。SF兼具液体的溶剂化能力和气体的低黏度、高扩散系数很难在同一条件下实现。低压或高温条件下，SF密度低，像高黏度气体，溶剂化能力低，扩散速率比气体低，欲达到一定柱效则分离时间增加；随压力升高，密度增加，类似液体，溶剂化能力上升，扩散系数低，难以保持开管柱柱效，但填充柱仍可获得高于常规HPLC柱效。然而，常规HPLC-仪器稍作技术改进的超高压HPLC，即可获得超高效、高速的优点。SFC自身物态的稳定性和仪器设备上的成熟性均不及GC和HPLC，被挤在技术上相当成熟、广泛应用的GC和HPLC之间，其发展成本和空间受到一定制约，难以成为与GC和HPLC相媲美的常规分离分析技术。尽管如此，SFC作为GC和HPLC的补充，仍不失为难挥发、易热解的高分子化合物、天然产物的二种可供选择的有效、快速分离方法，成为近代色谱学发展中一个有价值的领域。对制备分离，有重要发展潜力。

二 超临界流体色谱仪

SFC仪流程兼有气相色谱仪和高终相色谱仪两方面特朴它既有丁GC的色谱柱恒温箱，又有HPLC的高压泵，整个系统基本上处于高压、气密状态，其流程图如图22-2所示。

1．高压泵

SFC常用高压泵主要是两种，一种是螺旋注射泵，另一种是往复柱塞泵。一般泵的缸体要冷却至0-10℃，要求工作压力≧400×105Pa，流量0.01一5.00mL/min范围内可调，并能快速程序升压或程序升密度，且重现性好，压力脉动尽可能小。此外，要求泵体耐腐蚀。过去多数SFC仅有一个泵，当使用二元或多元流动相时，使用预混合钢瓶，使流动相组成随压力降低而变化。现已有两泵SFC系统，一个泵引入CO2或其他主流体，另一个泵引入单一或混合改性剂。通过控制泵速而改变混合流体体积比。

2．进样系统

SFC一般采用HPLC手动或自动进样阀。对于填充柱，采用带试样管的Rheodyne型六通进样阀。对毛细管柱，采用类似气相色谱的动态分流及微机控制开启进样阀时间的定时分流进样；亦可与SFE在线连用柱头进样等。进样重复性不仅与进样方式有关，而且与进样温度、压力有关，需严格控制。

3．色谱柱

常用色谱柱型主要有毛细管柱或开管柱、毛细管填充柱和填充柱。开管柱为内径50一100μm石英厚壁毛细管，固定相液膜厚0.25到几个微米，一壁厚≧200μm，可承受（400--600)×105Pa的高压，柱长10-20m。填充毛细管柱为内径250-530μm厚壁毛细管，填料粒径3-10μm，长20-100cm。填充柱填料粒径等与HPLC类似，柱内径2-4.6mm，长10-20cm。

4．限流器（restrictor

亦称为阻尼器，这是SFC中不可缺少的关键部件之一。根据检测器类型，限流器分别置于检测器前或后，为氢火焰离子化检测器（FID),限流器的入口端是色谱柱，出口端是检测器，它的作用是一方面保持分离系统流动相处子超临界状态，检测器则工作于常压气态；另一作用是色谱柱流出物，包括流动相和试样组分，通过限流器迅速实现相变和转移。若为HPLC检测器，则限流器处在检测器后，保持流动相在分离、检测系统均处于超临界状态。

限流器的结构是一段细内径毛细管、一个细口径喷嘴或一个烧结的微孔玻璃喷嘴。根据色谱柱的类型和结构，可改变限流器的管径、长度和喷嘴或微孔孔径以实现限流调节前后压差，实现相变、难挥发和极性试样组分转移。这种相变和转移能否成功则取决于限流器设计、流体压力和温度。超临界流体通过限流器的相变是个膨胀、吸热过程，因此限流器一般都保持在250-450℃。

5．检测器

各种GC和HPLC检测器均可用于SFC。使用最多的是FID，限流器到FID喷嘴的最佳距离是5-7mm。流动相含有机改性剂时，不适用于FID，因而采用蒸发光散射检测器（ELSD）作为通用检测器。元素选择性检测器，如电子捕获（ECD)、火焰光度检测器（PFD)、氮磷检测器（NPD）等均用于多氯联苯、有机磷、硫、氨基甲酸酯农药等测定。紫外吸收（UV）是含有机改性剂流动相常用检测器，要求检测池必须耐高压。各种结构分析检测器，包括MS,FTIR,NMR均已用于SFC。此外能用于SFC的检测器还有等离子体发射光谱检测器、电导检测器、荧光检测器等。

三 流动相和固定相

常用超临界流体的物理性质。超临界流体的溶解度参数是密度的函数，即流体密度越高则其溶解度参数值越大。流动相的选择还要考虑它的腐蚀性、毒性及与检测器的匹配。SFC中流动相不仅是运载溶质通过色谱柱，而且与溶质作用参与分配过程。CO2是SFC最常用的一种流动相，它的优点是临界温度较低、纯度高、化学惰性、价格低廉和安全性好，与检测器匹配性能也较好。其溶剂力与异丙醇和毗喧相当，可分析大部分非极性和中等极性试样。它是一个非极性流动相，对极性试样溶解性能较差。当分析强极性试样时，可在CO2流体中加入甲醇、乙醇、苯等有机改性剂。加入改性剂或采用二元或多元流动相，是SFC色谱条件优化的重要方法之一。但改性剂加入有导致保留值和选择性重复性差的缺点。

六氟化硫流动相主要用于烷、烯、芳烃的族分离及多环芳烃分离，以FTIR为检测器，可获得更多的光谱信息。氖气的临界参数比较合适，被认为是CO2的替代物，尤其适用在线光谱检测，其缺点是价格昂贵。

可选用的极性流动相较少。氨是个极性流动相，适用于胺、氨基酸、多钛、单糖、多糖和核苷等分离。但氨具腐蚀性、有毒、化学性质活泼等是其缺点，它不是一个理想的流动相。超临界水也可用作流动柑，其临界温度高是缺点，但它能溶解多数有机物，也不存在废溶剂回收问题。

SFC可使用HPLC和GC中各种固定相。填充柱微粒填料主要是硅胶化学键合固定相，包括ODS及辛基、苯基、氰基、氨基、全氟烷基、二醇基等，粒径3-10μm。用填充柱分析极性试样时，大多需在流动相中添加极性改性剂。

开管柱固定相主要是聚甲基硅氧烷（SE-30、SE-33、SE-54、OV-1、SB-Phenyl-30等）、苯基甲基聚硅氧烷、交联聚乙二醇等。为了能承受高压流动相冲洗，固定相大多数都需交联固化。在手性分离中使用较多的是环糊精类固定相。

四 超临界流体色谱分离操作条件

SFC与GC分离操作条件不同，其操作压力较高，一般为（70-450)×105Pa;和HPLC也不一样，其色谱柱工作温度较高，从常温到250℃。流动相的压力和密度在每一温度下以同样方式影响保留值，甚至在类似GC区也一样，增加压力，k值降低。而在较低温度下与HPLC的保留行为相似，k值随压力增加而降低。

CO2不同温度下压力一密度关系图，其溶解度参数亦随压力、温度变化。随压力升高，密度升高，溶解度参数上升，但在相同压力下，密度随温度升高而降低。且这些变化关系均不呈线性。SFC常采用程序压力、程序温度操作，包括线性压力／密度程序、非线性压力／密度程序、线性温度程序和非线性温度程序。在实际分析中可根据情况灵活选择。对一些较复杂试样，可采用同步密度、温度程序操作。

五 SFC与气相和高效液相色谱的比较

基于超临界流体密度、扩散系数、黏度等物理性质介于气体和液体之间，可以预计，在最小板高色谱条件下，分析速度和柱效SFC亦介于GC与HPLC之间。根据速率理论方程，柱内径dc的毛细管柱最佳流速uopt及保留时间与柱效比（tR/N）的极限值分别为

uopt=√B/C=4.2DM/dc

(tR/N）＝1/24×dc2/DM×pi/po×(1+k)×[f(k)]2

式中DM为流动相扩散系数，pi,po为色谱柱进、出口流动相压力，k,f(k)分别为容量因子和容量因子函数。分析速度或单位时间可获得柱效与流动相扩散系数成正比，其顺序为GC>SFC>HPLC。与HPLC相比，SFC单位时间内可获得更高柱效。

SFC和HPLC的H-u曲线比较说明，当平均线速为0.6cm·s-1时，SFC柱效约为HPLC的3倍；而最小板高Hmin对应的最佳流速uopt,SFC是HPLC的4倍，即SFC的分析速度比HPLC快4倍。

SFC与GC比较，由于超临界流体扩散系数比气体低，赫度比气体高，较低线速下SFC色谱峰较窄，柱效优子GC；超临界流体密度比气体高，色谱过程中与溶质分子间相互作用，参与分离，以提高分离选择性，区别于GC流动相基本不参与分离；SF溶剂化能力比气体强，能在比GC较低温度下分离高分子化合物、天然产物和热不稳定化合物。

六 超临界流体色谱的应用

SFC可弥补GC和HPLC在分析性能上的某些不足，分离效能和分析速度介于两种色谱方法之间。SFC可分析不宜用GC分析的一些物质，如强极性、强吸附性、热稳定性差、难挥发的化合物；它可分析相对分子质量比GC大几个数量级的物质。几种色谱技术可分离试样的相对分子质量范围。SFC可分析HPLC难以检测的各种化合物，如无紫外吸收的各种天然产物、高分子聚合物。

现在SFC已用于分离分析脂肪酸甘油酯、类脂物、胆固醇、胆汁酸、脂溶性维生素、街体类药物、氨基酸、多肽、石油中高级脂肪烃（>C100)、高级脂肪醇、烃基聚硅氧烷、聚乙二醇、聚醚、金属有机化合物、聚烯烃等。此外，SFC已用于热力学和溶液理论研究。测定溶质在高压下的吸附、萃取、扩散过程和相关物理化学常数。SFC分离乙二醇齐聚物的典型色谱图。