食品中副溶血性弧菌的检验

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是分布极广的海洋细菌，是引起食物中毒的重要病原菌之一，于1950年从日本一次暴发性食物中毒中分离发现。该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中，具有嗜盐性，在pH 7.7、37℃、含氯化钠的环境中生长最好。日本、东南亚、美国及我国台北地区多见，也是我国大陆沿海地区食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。

一、基础知识

a、生物学特性

副溶血性弧菌属于弧菌科弧菌属。

(1)形态与染色副溶血性弧菌为一种圆头短杆菌或中间胖的革兰氏阴性杆菌，(0.3-0.7)um×(1-2)um。无芽抱，无荚膜，在液体环境下生有一根极生鞭毛，运动活跃。在琼脂上有的产生周生鞭毛。在液体培养基上浑浊生长，生长菌膜。培养Id后在显微镜下易成为多形态者。有棒状、弧状、卵圆、球状、丝状体出现，两端浓染。

(2）培养特性副溶血性弧菌需氧或兼性厌氧，嗜盐畏酸，在含盐3％-3.5％的培养基中，37℃, pH 7.5-8.5时生长最好。在无盐时不能生长，3％-6％食盐水繁殖迅速，每8-9min为1周期，低于0.5％或高于8％盐水中停止生长。低于10℃不生长，最高生长温度42-43℃，最适生长温度35-37℃。在海水中15℃以上逐渐繁殖，20℃以上迅速繁殖。不耐热，56℃, 5min即可杀死，90℃ , lmin灭活。对低温及高浓度氯代钠抵抗力甚强。对酸敏感，在2％醋酸中或50％的食醋中I min即可死亡。比一般菌耐碱。在pH 5.6-9.6下生长。

(3）生化特征副溶血性弧菌的主要生理及生化特征见表4-15。葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇分解均阳性；蔗糖、乳糖、纤维二糖、木糖、肌醇、水杨苷均阴性。氧化酶阳性区别于肠道杆菌；葡萄糖氧化一发酵试验为发酵型，区别于假单胞菌（氧化型）；液化明胶；分解淀粉；硝酸盐还原阳性。

副溶血性弧菌有0抗原（1一13), H抗原和K抗原（69种，1-75, 2, 14, 16, 27,35、62空缺），因H抗原为共同抗原，在鉴定中一般使用0抗原和K抗原。过去以04: K8为主。03: K6为近年来较流行的血清型。1998年后又出现04:K68。

b、流行病学

弧菌属中的常见致病菌有霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌，它们都可能在食品中出现，成为食物中毒的原因菌。另外溶藻性弧菌、河弧菌、弗氏弧菌、梅氏弧菌、霍利斯弧菌有时也成为人的致病菌。弧菌作为食物中毒菌源于生的和未充分煮熟的有壳的水生动物。按报道的食物中毒的频率由高到低，依次为副溶血性弧菌、非O1/O139霍乱弧菌、创伤弧菌、霍利斯弧菌、弗氏弧菌和O1霍乱弧菌。

副溶血性弧菌多存在于海水和淡水交界处、海底沉积物、沿岸海水和鱼贝类食物中。温热地带较多。我国华东沿海该菌的检出率为57.4％一66.5％，其发病有季节性，尤以夏秋季较高。海产鱼虾的带菌率平均为45％- 48％，夏季高达90％腌制的鱼贝类带菌率也达42.4％，食物中毒多发生于沿海地区，常造成集体发病。中毒一般多发于5-11月份，高峰季节在7-9月份。近年来沿海地区发病有增多的趋势。目前有的沿海城市副溶血性弧菌食物中毒占细菌性食物中毒的第1位。

在海水中海藻和甲壳素可促进副溶血性弧菌的恢复生长。目前认为副溶血弧菌产生的毒素主要有3种，分别为不耐热溶血毒素TLH、耐热直接溶血毒素TDH和相对耐热直接溶血毒素TRH.

TDH是由165个氨基酸构成的二聚体，分子质量为46kDa，其热稳定性好，100℃处理10min仍有活性。TDH具有直接溶血活性，可使多种红细胞发生溶血，其中，兔、犬、人、豚鼠的红细胞对TDH较敏感。同时，小鼠心肌细胞培养证实TDH有心脏毒作用，可以导致心脏病，TDH也可使细胞膜上形成小孔通道，使细胞内外离子浓度发生改变，离子浓度的变化可以导致渗透压的变化，当渗透压的改变超过细胞的代偿调节能力时，可以使细胞发生病理和形态学改变，导致细胞膨胀甚至死亡，所以TDH又被认为是一种孔蛋白。TRH是与TDH的氨基酸序列的同源性达67％，有相似的免疫原性，具有溶血与肠毒素作用的一种二聚体蛋白质，分子质量为48kDa，其热稳定性较TDH差，60℃处理10min即可失活。与TDH比较，牛、羊、鸡的红细胞对TRH较敏感，而对TDH不敏感，马的红细胞对两者均不敏感。TLH是由两种具有交叉免疫原性、分子质量为43kDa和45kDa的蛋白组成的，两种蛋白具有同样的生物活性，被认为是同一基因的产物。它不但能溶解人的红细胞，而且溶解马的红细胞。实验表明，TLH是一种非典型的磷脂酶，不能直接溶血，需要卵磷脂才有溶血活性。关于TLH的功能和致病性目前仍不清楚。

一般地，致病性副溶血性弧菌有溶血性（R溶血），称为神奈川现象；无致病性的无溶血性。该热稳定溶血毒素（TDH）在100℃ 15min热处理下不被破坏。个别无神奈川现象的也发现有致病性，其含有热稳定溶血毒素相关溶血素(TRH)，此时尿素酶总是阳性。致病性主要在于热稳定溶血毒素。热稳定溶血毒素相关溶血素也是致泻因子。有时两种毒素都产生。

食品中副溶血性弧菌（也称嗜盐菌）直接或间接来源于海洋性食物。本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍品，常常能污染鱼、虾、贝类等海产品；其次为肉类、家禽和咸蛋，偶尔也可由咸菜等引起。人们往往因食用未煮熟的海产品或污染本菌（多因食物容器或砧板污染所引起）的盐渍食物（如蔬菜、肉、蛋类等）而受感染，导致食物中毒现象的发生。近年来国内报道的副溶血性弧菌食物中毒，临床表现不一，可呈典型、胃肠炎型、菌痢型、中毒性休克型或少见的慢性肠炎型。

二、常用检验培养基及检测原理

1、 TCBS琼脂（硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂）

TCBS琼脂原理类似肠道杆菌培养基，主要是增加了氯化钠。适当氯化钠浓度抑制不耐盐的革兰氏阴性菌；用适当碱性（pH9)提高竞争力，使弧菌优势生长。用胆盐（抑制菌落扩散）和硫代硫酸钠破坏细菌膜系统，用柠檬酸钠络合渗漏的重要无机离子，抑制革兰氏阳性菌。用硫代硫酸钠为还原剂，适当降低氧化-还原电位，使兼性厌氧的革兰氏阴性菌成为优势菌。用氯化钠抑制肠道杆菌。因此适合柠檬酸盐阳性的弧菌等微好盐兼性厌氧革兰氏阴性菌生长。因氯化钠浓度相对高，抑制变形杆菌、沙门氏菌等肠道杆菌，使之菌落小，呈半透明状（有的可能还产硫化氢，菌落发黑）。沙雷氏菌、个别的假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌（黄色菌落）、邻单胞菌（浅绿色菌落，生长不良）也生长。发光杆菌属、肠球菌属也能生长。本培养基因含硫代硫酸钠还能抑制扩散生长的弧菌。使用两种指示剂（溴麝香草酚蓝：黄6.0-7.6蓝。麝香草酚蓝：黄8.0-9.6蓝），使培养基pH在7.6-8.0范围变成中间颜色—绿色。这里用蔗糖排除分解蔗糖的杂菌和其他弧菌。不分解蔗糖的副溶血性弧菌在此培养基上形成大而扁平、半透明、带黏性的蓝绿色菌落，尖心，斗笠状。分解蔗糖的霍乱弧菌等在此培养基上形成黄色菌落。此培养基的优点是除柠檬酸盐阴性的霍利斯弧菌外其他致病性弧菌都能在此培养基上生长。能产生蓝绿色菌落的主要有拟态弧菌、创伤弧菌。TCBS琼脂还适合霍乱弧菌的分离。

2、 TSAT琼脂

TSAT琼脂是在胰大豆肉汤中添加蔗糖、氯化钠、胆盐和TTC组成的培养基。检验海产品时，在TCBS琼脂上经常有溶藻性弧菌与副溶血性弧菌一同出现，不易区分。在TSAT琼脂上副溶血性弧菌菌落为紫红色（直径2-3mm, 24h)，而溶藻性弧菌为白色，个别微粉红色，且菌落小（直径1-2mm, 24h)，二者容易区分。肠道杆菌也能在此培养基上生长，但一般菌落较小。变形杆菌菌落较大容易跟副溶血性弧菌混淆，但在以后的三糖铁上很容易区分。TSA+TTC中可以方便观察副溶血性弧菌动力。

3、3.5％盐三糖铁鉴定

可疑菌落接种到3.5％盐三糖铁上培养，挑取硫化氢阴性，不产气，斜面不变，底层产酸者进行生物化学试验。变形杆菌产生硫化氢而被排除。革兰氏阴性非发酵菌底层不产酸而排除。气单胞菌能利用蔗糖或乳糖而斜面产酸。通过涂片镜检，排除选择性平板上生长的耐盐的不能利用蔗糖的革兰氏阳性杆菌和球菌。剩余菌主要为弧菌属细菌。其他还有个别气单胞菌和发光杆菌。气单胞菌在8％ NaCl中不生长。发光杆菌可通过暗处发光来排除，也可通过甘露醇为唯一碳源试验（一）排除，还有一个特征是三糖铁上产气。

4、神奈川现象

副溶血性弧菌在普通血平板（含羊、兔或马等血液）上不溶血或只产生a溶血；但在特定条件下，某些菌株在含高盐（70g/L NaCl）的人O型血或兔血及以D-甘露醇为碳源的我妻（Wagatsuma）氏琼脂平板上可产生β溶血，该现象称为神奈川现象，其可作为鉴定致病性与非致病性菌株的一项重要指标。

神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素TDH，其阳性结果为菌落周围呈半透明的β溶血。

三、国家标准检验方法

参照GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》。

1、检验程序

副溶血性弧菌检验程序见图4-18.

2、操作步骤

（1）样品制备

①非冷冻样品采集后应立即置7-10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2-5℃不超过18h解冻。

②鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。

③以无菌操作取样品25g (25mL)，加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质lmin，或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1-2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备成1：10的样品匀液。

(2）增菌

①定性检测：将上述1：10样品匀液于（(36±1)℃培养8-18h。

②定量检测

a．用无菌吸管吸取1：10样品匀液1mL，注入含有9mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备成1：100的样品匀液。

b．另取1mL无菌吸管，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一支1mL无菌吸管。

c．根据对检样污染情况的估计，选择3个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置（(36±1)℃恒温箱内，培养8一18h。

(3)分离对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下lcm内蘸取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。1支试管划线1块平板。于（36±1)℃培养18一24h。

典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2-3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过lh)挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。

(4)纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，(36±1)℃培养18一24h。

(5）初步鉴定

①氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜（24h)菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在l0s之内呈现粉红或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色为氧化酶试验阴性。

②涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽孢，有鞭毛。

③挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，(36±1)℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。

④嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0、6%, 8％和10%氯化钠的胰陈水，(36±1)℃培养24h，观察液体浑浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。

(6)确定鉴定取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，(36±1)℃培养24-48h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。

①甘露醇试验：从琼脂斜面上挑取培养物接种3%氯化钠甘露醇试验培养基，于（36±1)℃培养不少于24h，观察结果。甘露醇阳性者培养物呈黄色，阴性者为绿色或蓝色。

②赖氨酸脱羧酶试验：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于（36±1)℃培养不少于24h,观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。

③ VP试验：将3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种3%氯化钠MR-VP培养基，(36±1)℃培养48h。取1mL培养物，转放到一个试管内，加0.6mL甲液，摇动。加0.2mL乙液，摇动。随意加一点肌酸结晶，4h后观察结果。阳性结果呈现伊红的粉红色。

④ONPG试验：将待检培养物接种3%氯化钠三糖铁琼脂，(36±1)℃培养18h。挑取一满环新鲜培养物接种于0.25mL 3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1滴甲苯，摇匀后置37℃水浴5min。加0.25mL ONPG溶液，(36±1)℃培养观察24h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24h不变色。

(7）血清学分型（可选择项）请参考相关文献。

(8)神奈川试验（可选择项）神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关。用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种表面干燥的我妻氏血琼脂平板。每个平板上可以环状点种几个菌。(36±1)℃培养不超过24h，并立即观察。阳性结果为菌落周围呈半透明环的β-溶血。

(9）结果与报告当检出的可疑菌落生化性状符合表4-16要求时，报告25g (25mL)样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每克（每毫升）副溶血性弧菌的MPN值。