霉菌和酵母菌计数

霉菌和酵母菌计数可以反映食品被污染的程度。目前已有若干个国家制定了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制定了糕点和蜜饯食品中霉菌和酵母的限量标准，其他食品霉菌和酵母的限量标准也在制定中。

一、霉菌和酵母计数（倾注法）

参照GB 4789. 15-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，适用于测定各种粮食、食品和饮料中霉菌和酵母的计数。

1、培养基的选择

(1)马铃薯一葡萄糖一琼脂培养基（PDA）霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA做平板计数时，必须加入抗生素以抑制细菌。

(2)孟加拉红（虎红）培养基该培养基中的孟加拉红和抗生素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。

(3)高盐察氏培养基粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。

2、操作方法

(1)检样稀释及培养为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。有的规定在实际操作时，振摇时振幅要30cm,7s振摇25次。

①以无菌操作将检样（块状食品需剪碎后置灭菌乳钵磨碎）25g（或25mL)放入含有225mL灭菌蒸馏水带玻塞锥形瓶（液体样品瓶内需预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，做成1：10的均匀稀释液。

②吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌水的试管中（注意吸管尖端不要触及试管内稀释液），另换一支1mL灭菌吸管吹吸稀释液使其充分混合均匀（使霉菌孢子充分散开），做成1：100的稀释液。

③吸取1mL 1：100稀释液于含有9mL灭菌水的试管中，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，即换用一支吸管。

(2)倾注培养根据食品卫生标准要求或对样品污染的情况估计，选择2-3个适宜的稀释度（液体样品可以包括原液），在做10倍递增稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应立即将晾至46℃左右的马铃薯-葡萄糖一琼脂培养基或孟加拉红培养基15-20mL注入平皿中，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置25-28℃温箱中，培养5d，观察并记录结果。

3、菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的平板菌落数。

4、霉菌和酵母计数的报告

选取菌落数在10-150 CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记为多不可计。菌落应采用两个平板的平均数乘以相应稀释倍数，即为每克或每毫升检样中所含霉菌和酵母计数，以CFU/g（或CFU/mL)表示。

二、霉菌直接镜检计数法

常用的方法为郝氏霉菌计数法或称霍华德（Howard)霉菌计数法。本方法适用于各种加工的水果和蔬菜制品，如番茄酱、果酱和果汁等。霉菌可以作为一种指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐烂存在。此法系在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微镜视野。

2.1设备和材料

(1)显微镜霉菌直接计数用的双筒显微镜一定要有标准化视野，在90-125倍时视野直径为1.382mm。同时在一个目镜中装配有一个特制的测微玻璃圆盘，其上刻有每边长度相当于视野直径1/6的36个小方格。

(2）郝氏计测玻片系特制的玻璃载片，带有一个20mm×15mm的长方形平面，即计测室，其周围有沟，两侧各有一条高出长方形平面0.lmm的肩堤，盖片放在肩堤上面，盖片和长方形平面之间相距0.lmm。中央长方形平面，肩堤和盖片共同形成一个光学工作面。为了便于校正显微镜，计测玻片上刻有两条相距1.382mm的平行线，作为校正显微镜视野的标准线。

(3)稳定液0.5 %羧甲基纤维素钠溶液。在高速搅拌器的杯中加入500mL沸水，加2.5g纤维素胶和lOmL约为37％的甲醛，混合约I min，也可用3％-5％果胶或1％藻胶代替。用真空或加热的方法去除溶液中的气泡，调节pH至7.0-7.5。如无搅拌器，则可将干燥的稳定剂与酒精混合，以促进其在水中的溶解。

(4）其他折光仪、烧杯、玻璃棒、盖玻片等。

2.2操作方法

(1)样品制备

①番茄酱：用小烧杯称取约l0g样品，加蒸馏水稀释至约30mL，用折光仪测定其折光指数为1.3447-1.3460，即浓度为7.9％-8.8％。

②苹果酱：用小烧杯称取一定量的样品，加等量的稳定液制成样液。

(2）涂片用蒸馏水清洗郝氏计测玻片和盖片，擦干后，将盖片压在计测玻片的肩堤上，观察玻片和盖片之间形成的牛顿环，如无牛顿环，说明玻片和盖片不清洁，应重新清洗。用玻璃棒将制好的样液均匀涂布于计测玻片中央平面计测室上，盖上盖片。

(3)观测采用8-12.5倍目镜和10倍物镜，用刻有间距1.382mm平行线的计测玻片调节视野为1.382mm。将特制测微圆盘放入目镜中，使其上方格每边为视野直径的1/60将计测玻片置显微镜下，用90-125倍的放大倍数检查每个视野。每个样品应检查2个玻片，每个玻片至少检查25视野，即一共应观测50个视野，同一检样应该由2个入观察。

2.3霉菌菌丝的特征

(1)平行壁霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝体的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来像两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。

(2)横隔许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。

(3)菌丝内呈粒状薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。

(4)分支如菌丝不太短，则多数呈分支状，分支与主干的直径几乎相同，有分支是鉴定霉菌最可靠的特征之一。

(5)菌丝的顶端常呈钝圆形。

(6)无折射现象凡有以上特征之一的丝状体均可判定为霉菌菌丝。

2.4计算

观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。

①一根菌丝长度超过视野直径1/6;

②一根菌丝长度加上分支的长度超过视野直径1/6;

③两根菌丝总长度超过视野直径1/6;

④三根菌丝总长度超过视野直径1/6;

⑤一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌丝（包括分支）总长度超过视野直径1/6。

根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（％）报告结果。

计算公式：（阳性的可视划区／镜检的总可视划区数）× 100＝阳性比率％