鲜乳中抗生素残留的检验

由于大规模使用兽用抗生素，如动物饲喂抗生素饲料，治疗疾病使用的各种抗生素，这样在畜产品及乳内就产生了抗生素残留。当人们长期食用残留有抗生素的食品后，不仅会使在人体内寄生和繁殖的细菌产生耐药性，还能增加人类对抗生素的过敏反应。同时人类长期摄入含有抗生素的食物后抑制了肠道中正常的敏感菌群，而使致病菌、条件致病菌及霉菌，念珠菌大量增殖而导致一系列全身或局部的感染。另外，在牛（羊）乳中，如含有微量抗生素，将给乳品加工带来很多问题。如影响酸乳的正常凝结和乳酪的正常发酵成熟；降低脱脂乳及同类产品的酸度和风味，抑制了发酵菌的繁殖；影响了生产工艺中的质量控制。因此，检查乳中抗生素残留，确保其纯净，成为食品卫生的一项重要工作。

乳中抗生素残留对人类健康存在危害，其中危害最大的是青霉素、链霉素的过敏性休克及抗药性的产生。只要存在微量的抗生素即可能引起，所以原则上乳中是不允许抗生素残留的。但限于检测水平未能达到如此敏感度，故只能以检测阳性者为不合格，阴性者为合格，所以“允许量”实际上等于检测方法本身的敏感度。

目前国际上对乳中抗生素残留规定如下：在乳卫生管理上，许多国家规定乳牛（羊）在最后一次使用抗生素后的72-96h内的乳不可使用，我国规定的最后一次使用5d内的乳不可使用。

目前国际上公认并作为法定检测食品中抗生素残留的几种检测方法，首推嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法，此法由Kanfman于1977年创立，后由国际牛乳协会（IDF）证实并推广，美国于1982年起作为法定方法。此外还有藤黄八叠球菌管碟法和TTC法。我国2008年颁布的食品卫生微生物检验国家标准将TTC法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法列为国标方法。

1.1嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法

(1)嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法具有以下优点。

①用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬浮物代替藤黄八叠球菌过夜肉汤培养物作试验菌，性质更稳定，储存时间更长可达6-8个月。

②检测敏感度很高，能检出牛乳中青霉素G含量为0.005U/mL.

③方法简便、快速、省钱，2.5-4h即可出现抑菌圈。

④不仅能检测青霉素G，还能检测其他多种常用抗生素，如氨苄西林、头孢菌素、邻氯青霉素和四环素等。

⑤可作定量测定。

⑥不受消毒剂干扰。

参见GB/T 4789. 27-2008《食品卫生微生物检验鲜乳中抗生素残留检验》检验方法。

(2）检验程序见图7-5.

(3)操作步骤

①芽孢悬液：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌种划线接种于营养琼脂平板表面，于（56±2)℃培养24h后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板式再次划线培养，于（56±1)℃培养24h后转入（36±1)℃培养3-4d，镜检芽孢产率达到95％以上时进行芽孢悬液的制备。每块平板用1-3mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液10一20mL)。将洗脱液5000r/min离心15 min，取沉淀物加0.03mol/L的无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2)，制成10⁹ CFU/mL芽孢悬液，置于（80±2)℃恒温水浴中l0min后，密封防止水分蒸发，置于2-5℃备用。

②测试培养基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽袍悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为8×10⁵ -2×10⁶ CFU/mL。混合芽孢悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管200uL，密封防止水分蒸发，配置好的测试培养基可以在2-5℃保存6个月。

③培养操作：吸取样品100uL加入含有芽孢的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀，每份检样做2份，另外再做阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为100uL青霉素G参照溶液，阴性对照管为100uL无抗生素的脱脂乳，于（65±2)℃培养2.5 h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，必须再于水浴培养30min做最终观察。

④判断方法：在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色，保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于两者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30min再进行最终观察。如果培养基颜色仍然处于黄色与紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。

图7-5鲜乳中抗生素残留的嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检验程序

1.2嗜热链球菌抑制法（2,3,5-氯化三苯四氮唑法一TTc法）

氯化三苯四氮唑法最早由Neel和Calbert在1955年提出，能检出牛乳中青霉素含量为0.04U/mL, 1959年Parks和Doan认为TTC法在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片大致相同等，但对链霉素不敏感，对新霉素根本不满意。也有人认为消毒剂可干扰试验。1958年Dragen建议TTC法加做乳糖发酵产气试验及酵母培养，可以证明抑菌的效果究竟由抗生素还是消毒剂引起。

(1) 2,3,5-氯化三苯四氮唑法（TTC法）原理细菌生物氧化有三种方式，即加氧、脱氢和脱电子，相反即还原。当乳中加入嗜热链球菌后，如乳中无抗生素，嗜热链球菌就生长繁殖，在新陈代谢过程中进行生物氧化，其中脱出的氢可以和加在乳中的氧化型TTC结合而成为还原型TTC，氧化型TTC无色，还原型TTC红色，所以可使乳变红色。相反，如乳中存在抗生素，嗜热链球菌就不能生长繁殖，没有氢释放，TTC也不被还原，仍为无色，乳汁也无色。

选择嗜热链球菌，是因为它对青霉素较敏感，Adamse于1955年、Fleischmann于1964年提出，酸乳培养物较其他菌株对青霉素敏感10倍，而酸乳培养物主要是嗜热链球菌，少量是乳杆菌，检测牛乳中的抗生素主要是青霉素，所以选择嗜热链球菌。

TTC法的特点是方法简便、快速，无须特殊设备，因地制宜，故适于牧场、乳品厂及防疫站采用。但方法敏感度不够高，国外报道对青霉素的检出量为0. 04U/mL，上海市生卫生监督检验所的研究也是0.04U/mL。此敏感度在1967年前是适用的，但随着对牛乳中青霉素残留允许量越趋严格，TTC法就显得不够敏感了。

牧场常用抗生素治疗乳牛的各种疾病，特别是乳牛的乳房炎，有时用抗生素直接注射乳房部位进行治疗。因此，凡经抗生素治疗过的乳牛，其乳牛在一定时期内仍残存抗生素。对抗生素有过敏体质的人食用后，就会发生过敏反应，也会使某些菌株对抗生素产生耐药性，同时在加工上不能用于生产发酵乳。为了保证饮用安全和实际生产需要，检查乳中有无抗生素残留已成为一项急需开展的常规检验工作。TTC试验是用来测定乳中有无抗生素残留的较简易方法。

鲜乳中抗生素残留量检验应属于理化检验的范畴，但此法采用的是微生物的手段，因此将此法放入微生物学部分。我国国家标准食品卫生微生物检验，鲜乳中抗生素残留检验GB/T 4789. 27-2008检验方法如下。

(2)检验程序检验程序如图7-6所示。

图7-6鲜乳中抗生素残留嗜热链球菌抑制法检验程序

(3)操作步骤

①活化菌种：取一接种环嗜热链球菌菌种，接种在9mL灭菌脱脂乳中，置（36±1)℃恒温培养箱中培养12-15h后，置2-5℃冰箱保存备用，每15d转种一次。

②测试菌液：将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭菌脱脂乳，(36±1)℃培养15h±1h后，加入相同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成为测试菌液。

③培养：取样品9mL置于18mm×180mm试管内，每份样品另外做一份平行样，同时再做阴性和阳性对照各一份。阳性对照管用9mL青霉素G参照溶液，阴性对照用9mL灭菌脱脂乳，所用试管置于（80±2)℃水浴加热5 min，取出冷却37℃以下，加测试菌液1mL，轻轻旋转试管混匀，(36±1)℃培养2h，加4% TTC水溶液0.3mL，在旋涡混匀器上混合15s或振动试管混匀，(36±1)℃水浴避光培养30min，观察颜色变化，如果颜色没有变化，于水浴中继续避光培养30min做最后观察，观察时要迅速，避免光照过久出现干扰。

④判断方法：在白色背景前观察，试管中样品呈乳的原色时，指示剂中有抗生素存在，为阳性结果。试管中样品呈红色为阴性结果。乳最终观察现象仍为可疑，建议重新检测。

⑤报告：最终观察时，样品为红色，报告为抗生素残留阴性，样品依然呈乳的原色，报告为抗生素残留阳性。

本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素0.004U，链霉素0.5 U，庆大霉素0.4 U，卡那霉素5U。

(4)注意事项

①方法敏感度不够高：TTC法本身也是属于生物学效价检定中的稀释法，用来测定抗生素效价所依据的是不同稀释度的检样中细菌是否生长，所以得到的结果只能是一种范围而不是绝对值（例如2倍稀释的试验结果，只能是X与2X之间的一般范围），要使结果尽可能精确，就越要缩短稀释倍数的间隔，把范围变窄，求得的效价也更精确，然而间隔太近，稀释太微小，对终点的判别就困难，甚至无法判别阳性还是阴性，这就是生物稀释法本身固有的弱点，TTC法也不例外。

事实上TTC法对于青霉素含量为0.03U/mL, 0.025U/mL, 0.020U/mL也能检出，然而0.020U/mL时会出现时而阳性时而阴性，0.025U/mL时阳性机会多些，0.03U/mL应该说是可以检出的。

②消毒剂干扰问题：TTC法无特异性，嗜热链球菌生长TTC变红，不生长不变红。消毒剂和抗生素一样能抑制、杀死嗜热链球菌，故从TTC变化上反映不出是何者引起，曾有二位学者建议加做乳糖发酵产气试验及酵母培养试验。但实践经验告诉人们，当进行生乳和消毒乳检验时，不仅做TTC试验，而且同时还要做细菌总数测定。按国家卫生标准生乳细菌总数≤5×10⁵ /mL，消毒乳≤3×10⁴/mL。如果生乳和消毒乳细菌总数极低或无，TTC又是阳性，应怀疑消毒剂所致。因只有消毒剂才会杀灭多种细菌，抗生素残留只能杀死某种或数种细菌。

③TTC法对其他抗生素的测定：上海市食品卫生监督检验所的调查研究结果，乳中青霉素检出量是0.04U/mL、链霉素是5U/mL、庆大霉素是4U/mL、卡那霉素是50U/mL（新生霉素未做试验），结果较符合国外报道。

由于当前生乳中非法掺入抗生素屡有发生，故TTC法应进一步推广，以便在快速检出、防止掺杂方面发挥作用。

④配制培养基应注意以下问题：培养基必须由经过试验没有抗生素的脱脂乳粉加水复制而成，或者经过试验没有抗生素的生乳、消毒乳经脱脂而成。未经测定抗生素而制成的培养基往往是细菌不生长及TTC失败的原因。
无抗生素的脱脂乳粉按10%（w／v)加蒸馏水调制。

脱脂乳分装后采用间歇高压消毒2次，既减少营养损失又加强消毒效果。

⑤配制4% TTC溶液：无菌称取1g TTC溶解于25mL灭菌蒸馏水中，装褐色瓶于4-10℃冰箱储藏，如超过一天或变成褐色、黄色均废弃。也可先配制成20％溶液储藏，临用前取适量以灭菌蒸馏水5倍稀释（体积比）。TTC遇光会自动变色，故避光储藏。

⑥菌种的保存：由日本引进的嗜热链球菌，保存于3mL 10％脱脂乳中，于4℃冰箱保存，每3周传代一次，于室温保存，每2周传代二次。移种方法是用灭菌毛细滴管从菌种中吸取1滴加入3mL菌种培养基中，于37℃培养15h，因嗜热链球菌能使脱脂乳产酸凝固，故见凝固者表示接种成功。如培养时间过长会有乳清析出，营养消耗太多，不利菌种保存；如培养时间不足，不能凝固，说明菌种不在对数生长期，影响试验效果。菌种保存时，特别在移种时应防止污染，以免影响TTC试验。