一．核酸的质谱分析

(1)核酸的一级结构

核酸（nucleic acid)存在于一切细胞中，是与蛋白质相似的一种生物高分子，但核酸的构成单位不是氨基酸，而是核苷酸。近年来发现质谱法是进行核酸一级结构分析的最有力手段。在此，核酸的一级结构是指各核苷酸以及残基沿多核苷酸链排列的顺序。到目前为止，已知的核苷酸的种类不多，但是如果调整核苷酸的数目、比例和排列顺序，能够组成多种结构不同的核酸。由于戊糖和磷酸两成分在核酸主链上不断重复出现，各核酸所不同的只是碱基序列，因此碱基顺序是核酸一级结构的重要内容，用质谱法测核酸一级结构，也只是测定其相对分子质量和碱基排列顺序。

(2)核酸分子质量的测定

由于MALDI质谱仪器测定核酸过程中的信噪比和分辨率都很低，测试过程并不像测定蛋白质分子质量那么容易观察到信号。主要原因是核酸分子结构中含有磷酸基，导致整个分子极性和电负性都比蛋白质小，测试时容易缔合K⁺,Na⁺等碱金属离子形成质量大小不同的碱性离子络合物，在质谱峰中，发现涉及核酸分子质量的峰多而宽，很难准确定位到某一个值。此外，核酸分子本身所带的碱基有很强的紫外吸收，使分子接受了过量辐射能而易于破裂。这与蛋白质需借助强紫外吸收基质帮助其解吸不同，因此使用解吸蛋白质一类基质和激光参量，将得不到好效果。所以在20世纪90年代初，MALDI-TOF质谱已成功地分析了分子质量为数十万（10⁵）道尔顿的蛋白质，而当时分析的核酸只是含4～6个碱基，分子质量为数千（10³）道尔顿的低级寡核苷酸。近年来，有关MALDI基质的研究、样品制备技术的研究和电离机理的研究以及质谱仪功能的改进取得了进展，为MALDI质谱用于分析核酸一级结构带来了希望。

MALDI质谱用于分析核酸的困扰问题之一是基质或试样溶液中存在能够与核酸分子离子形成加合离子的像K⁺,Na⁺等碱金属离子，导致目标分子离子峰变得杂多凌乱，难以准确测定分子离子的分子质量。后来研究发现，若在样品中混入
过量铵盐，则可以克服这种干扰，因为大量铵离子的存在，几乎全部取代了K⁺、Na⁺等碱金属离子而成为（NH4₊^-核酸）加合离子。同时，NH₄⁺中更容易转移一个H⁺给核苷酸中的磷酸二酯基，使后者成为游离磷酸基，而铵离子本身则转变为氨分子逸去。于是加合离子干扰消失，质谱中呈现出相对单一的尖锐峰，H⁺转移过程可表示如下：

NH₄⁺·O-PO(OR)₂→NH₃+HO－PO(OR)₂

常用的铵盐为柠檬酸氢二铵或酒石酸二铵等。

MALDI质谱测核酸分子质量的另一个困扰问题是分子离子峰强度往往很不够，特别是长链多核苷酸，以致测不准分子质量。分子离子较弱的原因是分子离子不稳定，发生了裂解。核酸分子中所含碱基不同，其分子稳定性不同，因而MALDI质谱中分子离子度也不一样。一般含胸腺嘧啶(T）的核苷酸离子稳定性较高，丰度较强，含其他碱基（A,C,G）的较弱，其原因是含A,C,G碱基的核苷酸分子离子发生了裂解。研究表明裂解首先发生碱基质子化，然后N-苷键断裂从而失去碱基，同时磷酸二酯键的3'-C-0键断裂。

DNA是随着碱基离去而裂解的。碱基脱去的一个可能机理是1,2-反式消除反应，如图10-14所示，接着在核糖中的5’位或3’位发生骨架裂解。

图10-14 DNA的裂解过程

由于碱基质子化是DNA分子离子裂解失去碱基过程中必需的第一步反应，所以碱基对质子的亲和力是影响DNA分子离子磷酸二酯骨架稳定性和该离子强度的重要因素。在气相中各碱基核苷与质子的亲和力如下：

胸腺嘧啶脱氧核苷（dT）为224.4kcal^*/mol；

腺嘌吟脱氧核苷(dA）为233.6kcal/mol;

胞嘧啶脱氧核苷(dC）为233.2kcal/mol；

鸟嘌吟脱氧核苷(dG）为234.4kcal/mol。

可见胸腺嘧啶脱氧核苷与质子的亲和力最低，比其他三种脱氧核苷的质子亲和力要低8～10kcal/mol,所以胸腺嘧啶 最不容易质子化的。含这种碱基的脱氧核苷相对最稳定，最不容易失去碱基而发生骨架裂解，RNA的分子离子一般较DNA稳定，这是因为RNA分子内核糖环中的2'-羟基具有致稳效应，它使得脱氧核酸中的1,2-反式消除反应不能发生。根据核酸质谱裂解的机理，就有可能通过化学修饰来抑制分子离子的裂解，从而提高它们的稳定性，增强它们在质谱中的丰度。例如，经过化学修饰的7-重氮嘌吟核苷酸分子离子有较大的稳定性。又如将腺嘌吟和鸟嘌吟中7位的N原子换成C原子，它们对质子的亲和力就会下降，因此分子离子的稳定性也就增加。

MALDI质谱中分子离子峰弱的另一个原因是样品在探头上解吸效率和电离效率不高。为了提高DNA解吸效率，一般需选择合适的基质。常用的基质为羟基芳香羧酸，如3,5-二羟基苯甲酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（芥子酸),3-羟基
吡啶,3-羟基-4-甲氧基甲醛／甲基水杨酸、2-氨基苯甲酸／烟酸等。曾有人从46种基质中筛选出3-羟基吡啶-2-羧酸为分析DNA的最佳基质，曾用它分析了含10～67个碱基的单股寡核苷酸，激光波长为353nm或266nm，分子离子强度高，裂解碎片少。也有人建议用2,4,6-三羟基苯乙酮作基质。总之，到目前为止，基质的选择尚无固定的原则可循，需视不同的样品对象选择合适基质。

迄今为止，采用MALDI质谱分析出来的最大DNA分子为约含500个碱基对的双股核酸DNA，其分子质量为15×10⁴ Da.测试过程中采用的基质是3-羟基-2-吡啶甲酸，激光波长为266nm，加速电压为45keV。较高的加速电压的好处在于提高分子离子的动能，缩短了在加速区的停留时间，避免了它的裂解。样品虽然是双股DNA，但是在质谱中出现的却是单股体，这可能是由于在样品制备过程中发生了变性，或者是在质谱离子源内探头上解吸过程中转变为单股体。

一般_MALDI-TOF质谱的分辨率低，分析DNA有困难，特别不利于测序分析。为了提高其分辨率，曾采用延迟萃取（delayed extration）技术。这种技术在1.3m反射式MALDI-TOF质谱仪上分析了含12个碱基的寡核苷酸，测试分辨率高达7500。此外，如果将MALDI离子源与傅里叶变换质谱联用，还可提高分析DNA的分辨率。

正如MALDI质谱一样，EST质谱用于分析寡核苷酸不及用于分析蛋白质顺利，也同样是两个原因，其一是碱金属离子加合物的干扰；其二是分子离子易裂解，以致强度很弱。可采用加入铵盐置换的办法来消除K⁺或Na⁺的加合离子。将寡
核苷酸样品自含乙酸铵的乙醇溶液中沉淀析出，或者在样品中加入氨水溶液。若不用铵置换处理，则可观察到EST质谱中几乎所有的磷酸二酯基都结合有一个Na⁺。用铵盐处理后，甚至含高达48个碱基的寡核苷酸中都观察不到含Na⁺的加合离子。配有EST电离源的傅里叶变换质谱仪可用于DNA分析。

虽然EST所产生的多电荷离子可以扩展质谱的可测质量限度，有利于测定生物大分子的分子质量，但是多电荷离子不利于离子的结构测定。有报道借调控样品溶液pH或在其中加入有机酸、有机碱来抑制多电荷离子的形成。也发现用混
合溶剂，如咪唑、六氢吡啶和乙酸溶于乙腈-水中作为样品溶剂既可抑制钾、钠加合离子的形成，又可减少多电荷程度。
用EST-FT质谱可准确测定长链DNA的分子质量，如测定双股64体DNA,分子质量为39kDa，误差≤0.5Da。用ESI-FT-MS测得核苷酸分子质量可高达108Da。

3.糖类的质谱分析

关于测定寡糖和多糖的结构，传统的化学和生化方法是在酸的作用下，将其全部水解，然后经纸色谱或薄层色谱分析，再与标准样品对照，借助只厂值大小推断单糖的成分。并用GC法测出各糖的相对含量。用过碘酸氧化、Smith降解等确定糖的连接点，然后用酶降解，逐步测出糖链顺序，用光散射法或凝胶渗透色谱法测出多糖的平均分子质量。这样的测定程度既繁复又费时，工作量很大，分析精度不高，所需样品量大，并且分析结果也没有全部解决糖的结构问题。于是人们转而向仪器分析求助采用各种波谱分析法。在这些波谱法中，NMR法在解决糖的立体化学方面起着重要作用，特别是用高分辨超导核磁共振谱。但是多糖核磁共振谱的解析非常困难，因为信号峰重叠严重，并且灵敏度不高，进行多糖核磁共振分析往往需要毫克数量的样品，不适合机体内痕量糖复合物的分析。而质谱法则是解决糖结构的有效手段。

FAB, EST和MALDI软电离技术在分析测试高极性、难挥发、热不稳定的糖类样品中都有广泛的研究，而测定大分子糖类分子质量时选择TOF-MS和FT-MS，其结果比光散射法或凝胶渗透法精度高很多，特别是在LGMS和MS-MS对于分析糖复合物或多糖降解后的混合物中单糖和寡糖糖残基的鉴定和序列测定。但是质谱法并没有全面和彻底地解决糖的结构分析问题。在连接点的确定和测序中，质谱法还未能实现同分异构体的区分以及糖的立体化学结构。

MALDI-TOF-MS用于测定寡糖分子质量是比较理想的选择，但由于测试时产生的碎片离子较少，不能提供较多的结构信息。最近有人用源后衰变技术来弥补此缺点。但最有效的方法还是MALDI-FTMS-MS法。现举一例如下：用波长为337nm的氮激光，2,5-二羟基苯甲酸与乙醇(50 mg/mL）为基质。取自人乳中分得的两种寡糖（Ⅰ）和（Ⅱ）作样品，溶于甲醇中（lmg/mL)，取1 uL糖样液滴在MALDI离子源探头尖端，用干燥热空气流吹干，加入1 uL 0.Olmol/L NaCl溶液以增强信号强度，然后将1 uL基质滴入探头尖端。将探头深入离子源，按常规操作FTMS仪进行测试。