遗传连锁图是指通过遗传重组分析得到的基因(或遗传标记)在染色体上的线性排列图，基因间(或遗传标记)的距离通常用遗传重组值来表示。建立详尽的遗传连锁图一直是遗传学家们研究的目标，也是基因组研究的一项重要内容。借助饱和的遗传连锁图，可快速定位、分离重要经济性状基因，一旦分子标记显示与目标基因紧密连锁，就需要建立基因和基因附近区域物理距离之间的关系，为基因克隆和功能分析打下基础。这种基因在染色体上排列的实际空间位置，即为物理图。目前，植物基因组有4种图谱，即遗传连锁图、物理图、核苷酸序列图和基因图。这里我们就分子标记遗传连锁图的构建及应用作重点介绍。

一、遗传图谱研究的基本概况

从20世纪80年代起，植物遗传连锁图谱的研究大大推动了作物遗传育种的研究和发展。遗传图谱称为遗传连锁图谱(genetic linkage map)，是指基因组内基因以及专一的多态性DNA标记相对位置的图谱。构建遗传图谱的依据是同源染色体减数分裂过程中会发生交换，交换的结果便使染色体上的基因发生重组，两个基因之间发生重组的频率取决于它们之间的相对距离。因此，只要准确地估计出交换值，进而确定基因在染色体上的相对位置，就可绘制连锁遗传图。其研究经历了从经典的基因连锁图谱到现代的分子标记连锁遗传图过程。经典的遗传图谱主要是研究基因及其在所构成的连锁群(linkage group)中的线性关系，它不能告诉人们某个基因的具体位置，更不能克隆这一基因。应用上节所述的DNA分子标记则可以绘制饱和的分子标记连锁图谱。

Botsteine最早提出利用RFLP标记构建基因与分子标记的连锁关系，进而确定基因的位置；1987年，人类基因组第一张RFLP标记图谱在著名杂志Cell上发表。由于PCR技术的发展和应用，多种其他分子标记(如SSR)的开发利用，使得构建高密度的分子标记遗传图谱成为可能。在模式植物拟南芥和水稻等作物中，已成功地构建了多张高密度的遗传连锁图。在此遗传图谱的基础上，定位和克隆了多个符合孟德尔因子的重要基因；同时，高密度的遗传连锁图为全基因组的完全测序和基因组框架图的建立提供了重要的基础。

随着新的标记技术的发展，遗传作图的工作在许多物种中得到了飞速发展，图谱上标记的密度也越来越高。由于在植物上可方便地建立和维持较大的分离群体，分子连锁图构建工作的发展速度超过了对动物的同类研究。至今为止，已构建了包括各种主要农作物的高密度分子标记连锁图。拟南芥、番茄、水稻、小麦、大豆、马铃薯、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、棉花、油菜等作物中都构建了分子标记连锁图谱，并且随着新型标记的不断出现，位点数也在不断地增加。这些遗传图谱的绘制已使一些作物的遗传研究(如控制作物的各种病虫害基因的克隆，改良作物产量、品质性状等方面)取得了重大进展，并对分子标记辅助育种产生巨大的推动作用。

近年来，人们的注意力又转向利用SNP等高通量的分子标记。由于SNP在基因组内的数量巨大，且目前各种新技术，如DNA芯片或微列阵的技术开发和检测手段的进步，可以允许人们迅速地检测大数量的SNP；此外，基因组测序技术的发展，使得其他高通量的分子标记甚至直接测序的分子标记得到更多的应用，从而构建更趋饱和、覆盖全基因组的遗传连锁图。随着越来越多植物的遗传图谱趋于饱和，植物的物理图谱、序列图乃至基因图的构建逐渐成为可能。
这里需要指出的是，生物染色体上基因之间的交换和重组除与遗传距离有关外，还受许多其他因素的影响。因此，遗传图谱中基于重组率所确定的遗传图距只能显示标记之间的相对距离，它并不能直接反映核苷酸对数。用含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的克隆片段重叠群，是物理图的基本形式。它能反映出核苷酸序列间的位置和距离。利用相互重叠、覆盖某一区域的DNA片段序列信息，便可在这一区域寻找基因或做这一区域基因组的研究。以STS为路标的物理图与已建的遗传图进行对比，可以把某一区域遗传学上的遗传间距粗略地转换成物理间距。但在不同生物的遗传图谱上，或者即使同一遗传图谱上的不同区域，每一图谱单位代表的实际核苷酸对数(Mb/cM)往往存在很大的差异。因此，饱和遗传图谱的构建完成，并不意味着物理图谱或者序列图谱就能顺利完成。当然，遗传图谱的构建是其他图谱构建的基础。

二、分子遗传图谱的构建

分子标记遗传作图的原理与经典遗传作图一样，其理论基础是染色体的交换与重组。在减数分裂时，非同源染色体上的基因自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因由于在减数分裂前期工非姐妹染色单体间的交换而导致基因重组。重组配子(或基因型)的比例与基因位点在染色体上的距离呈高度正相关。由此，重组类型配子出现频率的多少(即重组率)就可用来表示基因间的遗传距离，其图距单位用厘摩(centi-Morgan,cM)表示。一个cM的大小相当于1％的重组率。正如上述，遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映基因在染色体上的实际距离。

(一)分子遗传图谱构建的原理

遗传连锁图构建的基础是遗传学中分离重组、连锁交换等基本规律。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因独立分配、自由组合，同源染色体上的基因产生交换与重组，交换的频率随基因间距离的增加而增大。位于同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起，而表现为基因连锁。它们之间的重组是通过一对同源染色体的两个非姐妹染色单体之间的交换来实现的。假设现有两个亲本P₁和P₂，针对某同源染色体上存在的两个位点(A-a,B-b)，它们的基因型分别可表示为AABB和aabb，两亲本杂交产生F₁, F₁与P₂进一步回交得到BC₁F₁。由于F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子，即AB和ab(亲型配子)以及Ab和aB(重组型配子)，后两者是由于两位点基因发生交换而形成的；BC₁F₁中应出现4种基因型(AaBb, aabb, Aabb, aaBb)。若这4种基因型比例符合1:1:1:1,则表明两个位点呈独立遗传，若这4种基因型比例显著偏离于1:1:1:1，则表明两位点可能连锁。若Aa和B-b位于同一染色体上，这两个基因在连锁区段上发生交换就会产生一定数量的重组型配子。重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的比例越大。重组型配子最大可能的比例是50％，这时在所有减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为独立遗传。

(二)遗传图谱构建的群体

目前，遗传图谱构建包括以下4个主要环节。

(1)选择适合作图的分子标记，根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合。

(2)建立作图群体，即具有大量分子标记处于分离状态的分离群体或衍生系。

(3)群体中不同植株或品系的标记基因型的分析。

(4)借助计算机程序建立标记之间的连锁分析。

因此，要建立好的遗传连锁图谱，首先应选择合适的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度、遗传图谱的准确性及适用性。亲本间的差异不宜过大，否则会降低后代的结实率及所建图谱的准确度。而亲本间适度的差异范围因不同物种而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。例如，水稻多选釉粳亚种间配制的群体；玉米的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记作图群体；而番茄的多态性较差，囚而只能选用不同种间杂交的后代构建分子标记作图群体。

依据遗传的稳定性一般将用于分子标记遗传作图群体分为两类。一类为暂时性分离群体，包括回交群体、F₂群体以及其衍生群体(如F_2:3)等。F₂群体是由所选择的亲本杂交获得F1，再自交得到的分离群体。该群体包含的基因型种类全面、信息量大、作图效率高、群体构建比较省时，不需很长时间便可得到一个较大的群体。但由于每个F₂单株所提供的DNA有限，且只能使用一代(暂时性)。若F₂分离群体是通过远缘杂交而来的，则远缘杂交亲本后代向两极疯狂分离，标记比例易偏离3:1，限制了该群体的作图能力。回交群体是由F₁代与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息量少于F₂群体，且可供作图的材料有限，不能多代使用。

第二类为永久性分离群体，包括重组自交系群体(recombinant inbred line, RIL)、加倍单倍体群体(doubled haploid, DH)等。RIL群体是由F₂代经一粒传(single seed de-scendant, SSD)多代自交或姐妹交使后代基因组相对纯合的群体。其基本选择程序是：用两个品种杂交产生F₁,自交得F₂，从F₂中随机选择数百个单株自交或姐妹交，每株只种一粒，直到F₆～F_n代，形成数百个重组自交系。除了两亲本的重组自交系外，目前还发展了多个亲本的重组自交系，以8亲本的重组自交系最为常见；通过单籽传或姐妹交构建RIL,从而增加RIL的遗传组成(图12-17)。

图12-17构建重组自交系示意图（Broman, 2005)

RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究，而且作图的准确度更高。与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面特点：群体中各品系的遗传组成相对固定，可以通过种子繁殖代代相传，可不断增加新的遗传标记；可以对性状的鉴定进行重复试验以得到更为可信的结果。这对抗病虫的多年多点鉴定以及受多基因控制且易受环境影响的数量性状的分析而言尤为重要。当然，建立RIL群体相当费时，而且有的物种很难产生RIL群体。
DH群体是通过对F₁进行花药离体培养或通过特殊技术(如栽培小麦或栽培大麦与球茎大麦杂交获得的杂种胚胎中源于球茎大麦的染色体逐步消失)而得到目标作物单倍体植株，再经染色体加倍而获得加倍单倍体群体。DH群体相当于一个不再分离的F₂群体，能够长期保存。但构建DH群体需组织培养技术和染色体加倍技术，由于DH群体个体数往往偏少，因而所提供的信息量常低于F₂群体。

(三)分子标记在遗传作图群体中的分离

F₂群体中有三种基因型，分别是两亲本纯合基因型和杂合型。回交群体中有两种基因型，即轮回亲本纯合基因型和杂合型。DH和RE、群体都只有两种基因型，即两亲本纯合基因型。显性和共显性标记在各种类型的作图群体中的分离情况是不同的(图12-18)。显性标记不管是父本显性还是母本显性，在F₂群体中都呈现3:1的分离比例；共显性标记则是1:2:1的分离比例。显性标记在回交群体中呈现1:1的分离比例(非轮回亲本表现为显性)或1:0的分离比例(即不分离，轮回亲本表现为显性)；共显性标记也是1:1的分离比例。显性和共显性标记在DH和RIL群体都呈现1:1的分离比例。

(四)分子标记遗传图谱构建

在分离群体中，每一个标记位点上的基因型可通过分子标记带型来确定。通过两位点上不同基因型出现的频率来估算重组交换值，或通过适当的统计方法(如似然比检验)对两个基因位点是否呈连锁遗传作连锁分析。存在连锁(r<0. 5)与不存在连锁((r=0.5)的概率可用似然函数表示，其比也称为似然比。似然比取以10为底的对数，即为LOD值。LOD值的大小反映了两位点基因存在连锁可能性的大小，该值越大，则基因存在连锁的可能性越大。当然，在构建分子标记连锁图中，由于每条染色体上都涉及许多标记座位，多位点间的排列顺序和相互间的遗传图距，需要进行多个位点的联合分析，即多点测验。对大量标记位点间的连锁分析，需要借助计算机及相关软件作分析处理。目前，国际上已开发出多个作图软件。在植物遗传作图应用中，应用最为广泛的软件是MAPMAKER/EXP,JoinMap等。连锁分析后，要通过作图函数将重组率转换为遗传图距。目前，有两种作图函数：Haldane作图函数和Kosambi作图函数，两者的区别是前者假定完全没有交叉干扰。Kosambi作图函数算出的图距比Haldane作图函数的图距小，且更为合理，因此在遗传学研究中得到了更广泛的应用。

图12-18显性和共显性标记在各种类型的作图群体中的分离情况

三、高密度(饱和)DNA标记连锁图谱

遗传图谱饱和度是指单位长度染色体上已定位的标记数或标记在染色体上的密度，通常用标记平均间距来表示。由于标记往往是非均一地分布在染色体上，标记间距会或大或小，在整个基因组中，需要一个度量(即相邻标记最大距离)来反映这种情况。因此，衡量图谱饱和程度，也会用最大间距这一指标。一般标记平均间距和最大间距越小，标记连锁图谱越饱和。一个基本的染色体连锁框架图大概要求在染色体上的标记平均间隔不大于20cM。如果构建连锁图谱的目的是为了进行主效基因的定位，其平均间隔要求为10～20cM或更小。用于QTL定位的连锁图，其标记的平均间隔要求在10cM以下。如果构建的连锁图谱是为了进行基因克隆，则要求目标区域标记的平均间隔在1cM以下。不同生物基因组大小有极大差异，因此满足上述要求所需的标记数是不同的。以人类和水稻为例，它们的基因组全长分别为3.3×10¹⁰ kb和 4.5×10⁸ kb，如果构建一个平均图距为0.5cM的分子图谱，则所要定位的标记数就要分别达到6600和3400个。几种生物不同图谱饱和度下所需定位的标记数如表12-2所示。

表12-2不同生物基因组大小及其图谱达到特定饱和度的标记数

假设以拥有12条染色体，每条长100cM，全长1200cM的生物为例，Tanksley等(1988)研究了所需标记数与图谱饱和度之间的关系，发现影响所需标记数的主要因素有两个。一个因素是标记间的平均距离，即图谱总长度除以定位的标记数，它反映了标记图谱的平均密度。对于染色体全长1200cM的生物，如果定位了120个标记，则标记间的平均距离为10cM。另一个因素是标记间的最大距离。标记在基因组上的分布是不均匀的。即使在一张平均密度很高的图谱上，仍然可能存在较大的间隙区。据理论推算，如果用于作图的标记是随机选择的，则当标记平均距离为lcM时，仍有可能存在10cM的间距。而若要将最大可能间距从10cM减小到5cM，则需要另外增加1000个标记。因此，通过提高图谱平均密度的方法来缩小最大标记间距是很困难的。在实际研究中，为了填补间隙，应有针对性地在间隙区上寻找标记，或寻找该间隙所在区域上有差异的亲本构建作图群体。但由于没有一种标记在基因组中分布是完全随机的，如着丝粒区通常以重复序列为主，因而以单拷贝克隆为探针的RFLP标记就不可能覆盖这些染色体区域，因此，为了提高标记的覆盖程度，往往需要采用多种标记手段。

遗传图谱的分辨力和精度很大程度上取决于群体大小。群体越大，则作图精度越高。但群体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的群体大小是十分必要的。合适群体大小的确定与作图的内容有关。大量的作图实践表明，构建DNA标记连锁图谱所需的群体远比构建形态性状特别是数量性状的遗传图谱要小。从作图效率考虑，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：一是从随机分离结果可以辨别的最大图距；二是两个标记间可以检测到重组的最小图距。作图群体越大，则可以分辨的最小图距就越小，可以确定的最大图距就越大。如果构建图谱的目的是用于基因组的序列分析或基因分离等工作，则需用较大的群体，以保证所建连锁图谱的精确性。在实际工作中，构建分子标记骨架连锁图可基于大群体中的一个随机小群体(如200个单株或家系)，当需要精细地研究某个连锁区域时，再有针对性地在骨架连锁图的基础上扩大群体。这种大小群体相结合的方法，既可达到研究的目的，又可减轻工作量。

作图群体大小还取决于所用群体的类型。例如，常用的F₂和BC₁两种群体，前者所需的群体就必须大些。这是因为，F₂群体中存在更多种类型的基因型，而为了保证每种基因型都有可能出现，就必须有较大的群体。一般而言，F₂群体的大小必须比BC群体大约1倍，才能达到与BC₁相当的作图精度。所以说，BC₁的作图效率比F₂高得多。在分子标记连锁图的构建中，DH群体的作图效率在统计上与BC₁相当，而RIL群体则稍差些。总体来说，在分子标记连锁图的构建方面，为了达到彼此相当的作图精度，所需的群体大小的顺序为F₂>RIL>BC₁和DH。