在试验开始后，每天或按一定时间间隔，取出1组培养细胞进行观察，从瓶皿中抽出盖玻片做各种方法的染色观察，瓶皿中余下细胞制成细胞悬液通过计数等手段检测细胞数量。总之，为检测药物对细胞生物学效应，可结合应用各种技术方法，进行有针对性的检测。

通过一些观测指标对细胞进行观察，才能了解药物对细胞的效应如何。各种药物对细胞的生物效应各不相同，必须选择相应的指标。下面列出了一些常用的检测指标。

(1)光镜细胞形态：杀伤性药物作用细胞后，可能有多方面反应，一是细胞的形态和生长特性发生变化，在光学显微镜下容易判定。可用倒置相差显微镜，也可用台盼蓝染色后一般光学显微镜下检测。细胞的形态和一般具有一定的特征，如神经细胞在体外生长，可以明显地观察到长长的轴突，当用杀伤性药物作用时，它的轴突会缩短。另一种是对细胞代谢和基因表达的变化。根据形态变化和生长速率变化的结果，可大致分为以下5个等级：

0度：细胞在一定剂量与时间的药物作用下，无任何反应，细胞形态正常，生长能力无改变，贴壁细胞紧贴瓶底，无脱落，细胞的折光性好，以（一）表示。

1度：细胞生长速度减慢，细胞分裂指数下降，细胞轮廓增强，有少量贴壁细胞开始脱落，胞质中出现颗粒，以（＋）表示。

2度：细胞生长非常缓慢，细胞分裂指数显著下降或近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，部分细胞脱离瓶底，胞内有颗粒堆积，以（＋＋）表示。

3度：细胞生长完全停止，分裂象消失，细胞回缩，相互间隙加大，细胞轮廓非常明显，大部分细胞脱落，胞质极度粗糙，内充满颗粒堆积，以（＋＋＋）表不。

4度：细胞全部脱落死亡，残余的细胞亦濒死或崩溃溶解，培养基的颜色显示为碱性，以（＋＋＋＋）表示。

(2)化学成分检测：有的药物对细胞功能的作用，常表现在对某种物质代谢产生抑制作用（如胶原），这种情况下可通过测试该成分在细胞内或培养液中的含量，即可检测药物的效应。对酶有作用时，可用组织化学方法或电泳等方法检测。Tor-ranceCJ等利用现代分子生物学技术，开创了一类针对产物检测的新的策略，它的检测速度快、自动化，而且在缺少对照细胞的情况下也可进行。作者将一具有K-ras基因突变的结肠癌细胞系DLD-1,通过同源重组的方法将其转变为无K-ras突变的细胞系。将DLD-1转染一种黄色荧光蛋白，而将缺失K-ras突变的细胞系转染有蓝色荧光蛋白，两细胞系在不加任何抑制物共同培养时则生长速度相同。研究者用此体系去筛选药物，在药物的作用下，如果黄色荧光增强，说明药物抑制了缺失K-ras突变的细胞的生长；如果蓝色荧光增强，则说明药物抑制了含K-ras突变的细胞的生长。运用这种方法，一共筛选了30000个化合物，发现一个胞昔类似物在体外具有抑制含K-ras突变的细胞的生长。

(3）超微结构的变化：细胞受药物作用后，形态上很容易发生改变，如成纤维细胞突起回缩、上皮细胞相互分离变成梭形等，在一般光学显微镜下很容易看到，但这些变化有时不可靠，需要通过电子显微镜检测，以超微结构观察到的改变为依据，如对细胞膜、微绒毛、内质网、线粒体、细胞核等微细结构的影响。

(4)细胞死亡检测：致死效应是药物检测中，特别是抗肿瘤药的重要指标。细胞死亡是一个很复杂的生命过程，首先应明确细胞死亡的概念。细胞崩溃、脱壁、溶解等是在显微镜下可观察到的细胞死亡现象，同样也不能完全仅依靠这些为依据，否则一些不能迅速发生效应的药物作用可能会被忽视。一般情况下，凡能引起细胞内功能紊乱、功能障碍或细胞生命活动不可逆停止的现象，都应视为细胞死亡的范畴。如氰化物抑制细胞氧化磷酸化过程，阻断ATP供应；氯霉素干扰蛋白质合成抑制细胞修复等等，上述改变的进一步发展，都会最终导致细胞死亡。

观察细胞死亡的方式，对药物机制的研究是重要的。细胞死亡的方式根据病理上分类有两种形式，一种是细胞坏死，另一种是细胞凋亡，后者是指一种有秩序、受控制并按某种预定程序发展的生理性自然死亡过程（参见相关章节）。有的药物可能只通过其中一种形式，而有的药物作用机制可能两者兼而有之。下表列出了两者的一些区别。

(5)细胞增殖和存活测定：台盼蓝染色观察和计算细胞的生长速率，可以确定细胞的存活状态。如需精确测定细胞的增殖和存活，则还需要进行克隆形成率（反映细胞的存活率）和克隆大小测量（反应细胞的增殖情况）。

(6）药物遗传毒性测试：反映化学药物的遗传毒性的检测可以分为四类：DNA损伤、基因突变、细胞遗传学改变（染色体畸变和姐妹染色单体互换）、细胞转化。这些检测是药物的常规测试的基础要求。

1)DNA损伤检测：

方法一：

【原理］

DNA链的断裂是化学物质对DNA造成损伤的常见形式。最常用的检测方法是DNA解旋的荧光测定（fluorescentassayofDNAunwinding,FADU）。其原理是：DNA在变性液里会发生DNA解旋，如果DNA的分子存在链的断裂，这种解螺旋的速度会加快，此时溴化乙啶(EB）在碱性溶液中特异性地嵌入DNA中而引起荧光值增加。通过测定荧光Qd值的增加，即可检测DNA断裂情况。

【操作】

①细胞悬液制备：用常规方法制备细胞悬液，使其细胞浓度为1×106个／ml。实验分为对照组、实验组，对照组设T（未变性）、B(空白）和P(部分变性）三组，实验组只设Pi（部分变性）组，每组三个平行管，每管0.6m1。

②每管细胞中加入0.6ml裂解液（9mmol/L尿素，10mmol/LNaOH,2.5mmol/LEDTA，0.3%Sarcosyl)，待15分钟后细胞裂解，T组加1.2m1抗变性液（1mol/L葡萄糖，14mmol/L巰基乙醇），各管沿管壁小心加入变性液Ⅰ(0.4体积裂解液溶于0.2mol/LNaOH）和变性液(0.4体积裂解液溶于0.2mo1/LNaOH）各0.3m1。然后B管立即超声处理（功率20%)20秒。变性温度和时间为：0℃,30分钟；15℃,30分钟。变性时需避光进行。B、P和Pi组各加入溴化乙啶液（1μg/LEB溶于13.3mmo1/LNaOH)，室温下MPF-4荧光分光光度计荧光测定，条件为激发光波长520nm，荧光波长590nm。

③由T、P、B管荧光值计算残存双链DNA百分数（D)：

D=［（P-B)/(T-B)×100%

为获得直线型剂量效应关系曲线引入Qd值：

Qd=100(lgPo-1gPi)

Qd值大小反映DNA链断裂程度的高低，值越大表明断裂越多，式中的Po为未处理细胞D值，Pi为处理的细胞D值。

方法二：

【原理】当染色体DNA断裂时，分子量与完整的基因组DNA相比比较小，通过离心可与之分离，进一步用荧光物质Hoechst33258染色，计算DNA的断裂的比率。

【操作】

①1000g离心收集细胞，细胞沉淀用1ml裂解液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，lmmol/LEDTA,0.2%TritonX-100）裂解2分钟。

②13000g离心20分钟，含有断裂的DNA存在上清里，转移上清至一新的管中；而完整的DNA存在沉淀中，用超声破碎。

③向两部分溶液中分别加入等体积的1μg/mlHoechst33258,37℃染色20分钟。

④于荧光分光光度计检测，激发光波长360nm，荧光波长450nm，计算断裂DNA占总DNA的百分数。

2)基因突变的检测：

［原理］人类和啮齿类动物的正常细胞内，其X染色体上含有次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，它能代谢嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤(6-TG）或8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)，形成一种致死性的核苷-5’磷酸盐，从而杀死正常细胞。在致癌物或致突变物的作用下，细胞X染色体上控制的HGPRT结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使细胞对6-TG具有抗性，这些细胞能够在含有6-TG的培养液中长成集落。凡能引起碱基替换、移码突变、缺失和基因重组的诱变剂，均能引起HGPRT基因位点突变，这种突变是不可逆的。已经广泛用于辐射剂量估算、遗传毒理学诱变机制等研究。

【操作】

①正常细胞的常规培养，在培养液中加入测试药物，在进行实验时要设立对照组，包括阳性对照（可用苯并花）和阴性对照组，而且药物要有浓度梯度。

②37℃培养30小时，加入6μl/ml细胞松弛素B，继续培养42小时。

③弃去培养液，用PBS洗2次。

④细胞悬液经冰醋酸：甲醇（1：3)固定。

⑤制片，Giemsa染色，显微镜下计数双核和多核细胞数。

⑥HGPRT基因突变的变异子数计算：分别计算含有6-TG与不含有6-TG的每1000个细胞中，计算出两类细胞发生双核或多核细胞数的比值。该结果反映了细胞HGPRT基因损伤情况，同时间接反映了其他基因组的基因突变状况。基因突变的剂量一效应关系，随致突变剂剂量增加而增加。

3）染色体畸变试验：

［原理］用于染色体畸变检测的细胞有人和动物的末梢血淋巴细胞，细胞系有中国仓鼠卵细胞(CHO)、中国地鼠肺成纤维细胞（V79)和中国仓鼠肺细胞系（CHL)、人胚肺2倍体成纤维细胞，最常用的是外周血淋巴细胞和CHL。在我国新药的染色体畸变试验推荐的首选细胞为CHL。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于细胞周期的G1和G0期，一般条件下木会再分裂，当培养物中加人PHA，在37℃下，经52一72小时的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。再经过秋水仙素处理、低渗、固定后在显微镜下可以观察到良好的中期染色体分裂象。当电离和化学有害物质作用时，均可引起染色体的损伤，且与剂量呈良好的线性关系。

【操作】

①用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，常规细胞培养，把细胞分为五组，即阳性对照组、阴性对照组和三个剂量组。最高剂量和最低剂量相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝裂霉素C，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉毒素B，浓度为10-6mol/L等。每组设三个平行样品。

②收集细胞，加入含有PHA的培养基（如果用CHL细胞则不需加）,37℃培养52-72小时。

③加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml，终溶度为0.4-0.8μg/ml,37℃培养4小时。

④收集细胞，加入8ml0.075mol/LKCl低渗液，制成单细胞悬液，37℃、20分钟。

⑤离心收集细胞，加入3ml冰醋酸，甲醇(1：3)固定细胞，用吸管轻轻吹打后，立即离心收集细胞。加入loml冰醋酸：甲醇(1：3)处理15分钟。反复操作2次，每次15分钟。

⑥取出冷冻预冷的载玻片，每片滴加1-2滴细胞悬液，吹散后，自然干燥后，在显微镜下观察有无细胞分裂象。

⑦Giemsa染色15分钟，用自来水冲洗残留液体，干燥后显微镜下观察。进行染色体畸变计数，并摄像。畸变的类型有断片（F)、双着丝粒(D)、环形（R)、互换（E)等，电离辐射常见断片、双着丝粒、环形等，而化学药物常见单体断裂。结果表示为：

总畸变率（％）＝（各种畸变类型细胞数／分析总细胞数）×100%

畸变率（％）＝（染色体畸变数／染色体总数）×100%

如果采用CHL进行此项实验，其结果判定是：

4）姐妹染色单体互换试验：

［原理]当细胞在加有BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷）的培养基中进行有丝分裂时，BrdU能取代胸腺嘧啶核苷酸而掺入到新复制的DNA链中。在经历了两个分裂周期，细胞中期染色体上的两条姐妹染色单体一条被BrdU掺入取代，被称为单链取代；细胞中期染色体上的两条姐妹染色单体均被BrdU掺入取代，则被称为双链取代。两者这种差别可借不同的染色方法将其分别开来。双链都含有BrdU的染色单体在Giemsa染色情况下呈浅染色，而一股链含有BrdU的染色单体时染色深，这种姊妹染色单体上染色深浅相间的现象称为姐妹染色单体分化现象（SCD)。已分化的两条染色单体之间如发生等位点交换的现象，称为染色单体互换（SCE)。

【操作】

①按常规细胞培养方法培养CHO细胞，加入受试物，作用2小时（亦可采用外周血细胞培养，但在培养过程中加入PHA)。

②弃去培养液，用Hanks液洗涤3次。

③加入含BrdU10lig/ml的完全培养液5m1，于避光条件下培养24-27小时。

④加入秋水仙素1-2滴（终浓度为0.2μg/ml)，继续培养4小时后，收集细胞。

⑤按常规用0.075mo1/LKCl低渗处理，再经冰醋酸：甲醇(1:3)固定，制片。

⑥标本在37℃条件下光化24小时后，置于大培养皿中，上盖以擦镜纸，滴加2×SSC液，以溶液不浸没玻片但能保持标本湿润为止。

⑦将大培养皿移至60℃水浴箱上，用20W紫外线灯距离5cm垂直照射30分钟。

⑧去掉擦镜纸，以3%Giemsa染液染色15分钟，自来水冲洗，晾干，镜检。

⑨以每个细胞SCE数计算SCE频率，每个样品至少观察25-50个细胞。

【注意事项】BrdU溶液最好现配现用，一次用不完，必须用黑纸（布）避光，4℃冰箱内保存。

BrdU溶液强致突变剂，使用浓度不宜太高，在25μg/ml左右的剂量下对细胞增殖无影响。在培养24小时后加入均可。

用紫外线照射诱发姐妹染色单体互换时，如果紫外线灯功率大，照射时间应相应减少。

经过t显著性检验后，至少有一个剂量组SCE频率超过对照组SCE频率3倍者为强阳性；若三个剂量组超过对照组SCE频率但不及3倍，但其中至少有一个剂量组与对照组有非常显著性差异（P<0.001)，则为弱阳性；否则为阴性。

5）细胞短期转化试验（药物致癌实验）：细胞转化是细胞发生涉及到DNA或基因改变，导致遗传性状改变的一种变化。细胞发生转化后的性状可以代代相传，能够长期维持和存在。观察药物对细胞是否有诱导转化作用，是药物致癌作用检测的常规技术。

【原理】体外培养的细胞在受电离辐射或化学致癌物的作用下，可发生细胞表型的转化，包括细胞形态转化及生长特性的改变，并形成转化克隆。而且，大量实验结果表明，细胞形态学的转化与体内肿瘤生长有密切的关系。一般细胞转化试验的周期需2-3个月，而应用叙利亚金黄地鼠胚胎细胞（SHE）作为靶细胞，经致癌因子作用后第9天即可检测出细胞形态的转化。此试验模型已广泛用于环境致癌物和各种药物致癌作用的检测，成为细胞毒理学中一个基本的实验方法。

【方法与步骤】

①原代细胞的制备及接种：采用常规建立细胞系的方法，取妊娠10-20天的叙利亚金黄地鼠的胚胎制备原代细胞悬液，接种细胞为1×106个细胞／ml。每个培养瓶加入1ml细胞悬液、2ml完全培养液及双抗，37℃温箱内培养。

②饲养层细胞的准备：直接采用次代培养的SHE细胞制备，每平方厘米生成面积接种3.3×104个细胞，培养基为RPMI1640或Eagle完全培养液，37℃下培养3-5天。待贴壁生长细胞80％融合时，进行X射线或60Coγ射线照射，剂量为5.0Gy。照射时细胞培养面朝上，照射后立即用胰蛋白酶消化，然后加入10％小牛血清的完全培养液，调整细胞浓度为2×104个／ml，接种4×104个细胞（2m1）于一系列25ml培养瓶中。受试物每一浓度组及对照组各12瓶，置37℃下培养24小时后，即可接种靶细胞。因饲养层细胞受到照射，细胞体积大，不增殖，形态特异，易与靶细胞区别开。

③靶细胞的制备：取冻存的SHE细胞，作常规培养，当细胞长到80％-90％融合时，即可用胰蛋白酶消化1-1.5分钟，以完全培养液稀释至300个细胞／ml，取1ml细胞悬液接种于饲养层细胞培养瓶中，总体积3m1。37％下培养24小时，加入受试物，可设立三个浓度的实验组，一个阳性对照组（如3-甲基胆蒽、3-MAC或N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍,MNNG)，浓度一般为1μg/ml左右。若受试物不溶于水，可先用二甲亚砜溶解，二甲亚砜在培养液中的浓度为0.02%(V/V)。加入受试物后，37℃下连续培养8天，此时细胞既不传代，也不换培养液。

④固定、染色：细胞培养至第9天，弃去培养液，用pH6.8磷酸缓冲液将贴壁细胞洗2次，最后加入甲醇3-5ml固定20分钟，再用Giemsa染液染色20分钟，最后经双蒸水冲洗，晾干。

⑤镜检：在低倍镜下观察细胞转化克隆的形态。转化克隆的成纤维细胞生长无方向性，排列紊乱，形成交叉、漩涡、复层生长（三维空间生长），染色深。正常细胞不形成克隆，或形成的克隆细胞生长有一定方向性，排列规则，基本上单层生长，染色浅。

⑥转化克隆的判断：为了便于判断克隆是否发生形态转化，可将每个克隆划分为三个区域。中心区：细胞最致密，常呈三维空间生长，细胞界限不清，非转化克隆无此现象。外周区：自中心区边缘向克隆周边延伸，在此区域中细胞单层生长，但排列不规则，形成交叉、重叠，而正常细胞呈方向性生长。细胞稀疏的区域：在克隆外周区之外可有一个细胞群体很稀疏的区域，在此区域内，细胞间隙较大，生长较紊乱，细胞突起重叠，但不典型。此区域中细胞形态不能作为判定转化克隆的依据。

⑦判定阳性结果的标准：根据Dumkel等的建议，SHE细胞准化试验中，符合以下标准者即可判定为阳性结果：明确的剂量一效应关系；两个连续剂量组中都有2个或2个以上的转化克隆；单个剂量组中，有3个或3个以上的转化克隆。

若出现以下情况中，仅属可疑阳性：单个剂量组中，只出现1个或2个转化克隆者；在两个不连续的剂量组中，出现1-2个转化克隆者；在两个连续的剂量组中，仅出现1个转化克隆者。

据此尚难作出明确判断者，需做其他实验进行确定，将所形成的克隆分离出来，进行染色体数目和核型分析、细胞凝集实验、半固体琼脂培养基中集落形成率测定、动物接种致瘤试验，以增强结果的可靠性。其中半固体琼脂培养最为可靠，当动物接种时出现肿物生长并结合病理确诊则最有说服力。

【注意事项】胚胎原代细胞比传代细胞更易于被转化，同胎动物的胚胎细胞转化结果较稳定。

小牛血清必须及时灭活，无微生物、支原体污染。活力低的血清或污染血清不易使细胞发生转化。

培养液配制保存时间不宜过长，否则会降低细胞转化率。

首次接种的细胞密度应高一些，由于接触抑制作用，减少细胞倍增次数，可提高转化率，否则会降低转化率。