细胞培养首先要将取来的组织标本分散成单细胞悬液。通常用机械分散法和酶消化法等制备单细胞悬液，组织小块经酶消化后需去除酶液，然后吹打组织获取单细胞，细胞计数并调整细胞浓度后接种培养。

【材料】

1．组织来源动物内脏或实体瘤等；

2．培养用液PBS液、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、2000U/ml（或1～3 mg/ml）胶原酶、0.02% EDTA, RPMI 1640液、含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液等；

3．培养器具无菌培养瓶或培养皿、离心管50ml或l0ml多个，无菌平皿、弯头吸管、小烧杯、手术刀、眼科剪、镊，磁力搅拌器、离心机等。

【方法】

1．来自实体组织的细胞分离

(1)机械分散法：对某些软组织如皮肤黏膜、内脏、神经、血管，胚胎以及某些肿瘤等，可采用机械方法进行分散。常用方法是用手术剪刀将其剪成小于1 mm³大小组织块（肉泥状），直接接种微小组织块；或用研碎组织，组织匀浆器要轻微旋转且保持一个方向旋转，然后通过不锈钢或尼龙网筛过滤获得单细胞悬液。此方法简便省时，但对细胞有一定损伤。

(2)酶消化法：酶消化法是先用剪刀将组织剪成较小体积的基础上，应用胰蛋白酶或胶原酶消化细胞间质，使之成为单个细胞。根据酶的作用机制和组织标本的不同，不同的组织标本要采用不同的酶消化。

1)胰蛋白酶（trypsin )消化法：胰蛋白酶适用于消化间质较少的软组织，对传代细胞的消化也适用。胰蛋白酶不同于胰酶，胰酶中除含有胰蛋白酶外，还有胰淀粉酶和胰脂肪酶。胰蛋白酶的消化程序如下：①将组织剪成约1 mm³大小，置于三角烧瓶中，加入比细胞多30～50倍的0.25%胰蛋白酶液，置电磁搅拌器上搅拌（30～100r/min )、消化30～60分钟，或放入37℃水浴中消化60～120分钟，但中间要不时多次摇动；②消化完毕后，吸取2/3上清液于离心管中,1000r/min离心5分钟，然后用Hanks液漂洗2次；③Hanks液漂洗过的细胞沉淀加入一定量的营养液再悬浮，用吸管轻轻吹打，通过200目不锈钢网或尼龙网滤过，即可用于培养。

上述在37℃环境下消化的方法称热消化法；有时也可将胰蛋白酶加到剪碎的组织中，置4℃冰箱内进行缓慢消化，消化时间可延长至12～24小时，此法称冷消化法。

2)胶原酶( collagenase）消化法：此酶对胶原组织有较强的消化作用，适于消化纤维组织、上皮组织及瘤组织等，将需培养的组织小块放入培养瓶内，加入含有血清的生长培养液4.5 ml，加入0.5ml胶原酶(2000U/ml）于培养液中，配成胶原酶的常用剂量为200U/ml。此酶消化作用缓和，消化过程与胰蛋白酶消化法基本相同。

在实际工作中，有时可联合应用胰蛋白酶和胶原酶消化某些硬组织，其消化效果更佳。酶消化时间过长对细胞有损伤，若消化不充分又达不到分散细胞的目的，因此在新条件下使用消化酶时应做些消化法的试探，以确定最佳的消化时间。

(3)鳌合剂（chelating agent）分散法：实验中常用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tet-raacetic acid, EDTA）作为化学鳌合剂，其溶液又称Versen液。使用浓度一般为0.02%。EDTA能从组织中吸收Ca²⁺和Mg²⁺形成鳌合物，促进细胞相互分离。EDTA比胰蛋白酶作用缓和，很少单独用于消化新鲜组织，常与胰蛋白酶合用（0.25％胰蛋白酶,0.02% EDTA）用于消化传代细胞，此法作用温和，毒性较小。

消化法获取的细胞通过200目孔径筛网滤掉组织块。已过滤的消化液经800～1000r/min低速离心5分钟后，去上清液，加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA消化液，还需用Hanks液或无血清培养液洗1～2次，以去除消化液，然后再加含血清的生长培养液，细胞计数后调整合适的浓度接种培养瓶，置5% C0₂孵箱、37℃培养。

2．来自血液、淋巴液等的细胞分离

(1)淋巴细胞的分离：取肝素抗凝血I ml加Hanks液1 ml稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内（小心叠加在淋巴细胞分离液的液面上，注意勿与分离液混合），然后2000r/min水平离心20分钟，离心后管内分为4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞、颗粒白细胞、红细胞（图2-1)。用毛细管伸至单个核细胞层中（位于细胞分离液与血浆的界面上），沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r/min离心10分钟，最后用RPMI 1640培养液将细胞配2×10⁶/ml的细胞悬液备用。

(2）单核巨噬细胞的分离：单核巨噬细胞有黏附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分离，其方法简述如下：将待分离的细胞悬液（实验动物的腹腔洗液）加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ CO₂温箱内温育1小时，然后用RPMI 1640培养液轻轻漂洗平皿表面，去除非黏附细胞，再将黏附有细胞的平皿表面用上述培养基轻轻刷洗，收集黏附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。

【结果】

单细胞悬液接种后，次日于倒置显微镜下观察，可见大量贴壁的圆形细胞，折光性好。约一周后细胞贴壁生长形成上皮样或梭形纤维细胞单层，有时可见微小的组织块形成若干“细胞岛”，即以组织块为中心向外周长出同心圆排列的单层细胞，且可见到从相邻细胞岛长出的细胞单层逐渐靠近，甚至融汇成片。待2周左右细胞几乎可完全汇合成一片。这种单层细胞因散在分布许多细胞岛，显得细胞单层的细胞密度极不均匀，会影响实验结果，故最好经传代一次，长出较均质的单层细胞后再进行试验。