肾小管上皮细胞培养的要点是从基质中可分离出肾小管细胞，因为这些细胞含有D-氨基酸氧化酶，能在D-缬氨酸中生长，而基质细胞则不行。用胶原酶消化切碎的肾脏组织10小时左右，经吸管吹打可获得肾小管及肾小球上皮细胞。

【材料】

1．组织来源Wistar大鼠，体重50g。

2．培养基RPMI 1640、新生小牛血清、胰岛素（5ug/ml) ,氢化可的松（36ng/ml)、入转铁蛋白（5 ug/ml)、表皮生长因子（10ug/ml）等。

3．消化液及试剂0.25%胰蛋白酶,Hanks液。

4．器具80目、100目不锈钢筛网或尼龙筛网、培养皿、解剖刀、剪、镊。

【方法】

1．大鼠于实验前12小时开始禁食，可自由进水。

2．大鼠麻醉致死，全身浸泡于75％乙醇中消毒后，于无菌条件下取肾，置于生理盐水的培养皿中，剥离肾包膜，用剪刀剪下肾皮质并将其剪碎，置于80目不锈钢筛网上研磨，并以生理盐水冲洗，将滤液倒至100目不锈钢筛网上，收集网上组织块移于培养皿中，充分吹打后，以1000r/min离心10分钟。

3．离心后弃上清液，加入0.25%胰蛋白酶1.5～2.Oml，充分吹打、混匀消化液与离心液，置37℃振动水浴中消化20分钟，1500r/min离心5分钟，弃上清液，加入5ml含有10％新生小牛血清的RPMI 1640培养液，充分吹打混匀后，移入培养瓶中，37℃, 5% C0₂孵箱内培养。

4．原代培养至第5～6天，细胞完全铺满瓶底，倒空培养液，加入少许无血清RPMI 1640培养液，洗细胞1次，倒出洗液后加入0.25%胰蛋白酶覆盖瓶底细胞即可，置37T孵箱中消化3～5分钟，约85％的细胞收缩变圆，少许脱落，立即加入双倍量含有10％新生小牛血清的RPMI 1640培养液，轻摇混匀，以弯头吸管顺底依次轻轻吹打，然后以1500r/min离心5分钟，弃上清液，加入含10％新生小牛血清的RPMl 1640培养液，充分吹打混匀，细胞计数后，分装入培养瓶中培养。

【结果】

1．大鼠肾小管上皮细胞的原代培养所获得的肾小管和肾小球细胞的形态呈多边鹅卵石样，体积较大，镜下透明度及折光性强，各细胞互相紧密衔接，可见融合成片及复层生长，呈蜂窝状。较分散的细胞贴壁后形态不一，体积增大，较为伸展。镜下透明度增大而折光力减弱。

2．首次传代的肾小管细胞于培养第2天贴壁，至5～6天更换新鲜培养液，第12～14天细胞可铺满瓶底，可顺次传至第13～18代，其后细胞贴壁逐渐减少。

3．肾小管细胞经细胞免疫化学染色，角蛋白18呈阳性表达。