玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN, ZEA或ZON)，又称F-2毒素，是由镰刀菌属的菌种产生的代谢产物，是一种雌激素真菌毒素。最早是由染有赤霉病的玉米中分离得到的。ZEN属于雷锁酸内酯，是一种白色结晶化合物，分子式C₁₈H₂₂O₅，相对分子质量318。不溶于水、二硫化碳和微溶于石油醚(30～60℃)，溶于碱性溶液、苯、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇等。在360nm的长波紫外光下，ZEN毒素呈现蓝绿色荧光，在260nm短波紫外光下绿色荧光更强，利用此性质可用来定性鉴别F-2毒素。ZEN的耐热性较强，110℃下处理1h才能被完全破坏。

ZEN毒素的产生菌主要是镰刀菌，如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌等。这些菌株主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布。虫害、冷湿气候、机械损伤和贮存不当都可以诱发产生玉米赤霉烯酮。

ZEN毒素具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经济损失。食用含赤霉病麦面制作的食品也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头疼、精神抑郁等。ZEN毒素可由口进入血液，7d内可在尿液中检出，致病机制同雌激素中毒症。我国规定ZEN毒素限量为60ug/kg 。

目前ZEN毒素的测定方法有免疫亲和柱-荧光计法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法及ZEN检测试剂盒法等。本试验主要介绍的是免疫亲和柱-荧光计测定法和高效液相色谱法。

(一)免疫亲和柱一荧光计测定法

1．检测原理

试样中的ZEN毒素用一定比例的甲醇一水提取，提取液经过滤，稀释后，用亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的ZEN毒素淋洗下来，在淋洗液中加入显色剂，然后用荧光计进行定量测定，ZEN毒素在紫外线照射下显蓝绿色。

2．试剂及仪器

4-系列真菌毒素专用荧光计；均质器(250mL)；微量移液器(1.0mL) ;涡流混合器；玻璃纤维滤纸(1.0um)；VICAM玉米赤霉烯酮亲和柱；聚乙二醇(PEG)，相对分子质量8000;甲醇及乙腈(色谱纯)；VICAMZEN衍生液；VICAM真菌毒素通用标定标准物；0.1％吐温～20/PBS缓冲液。

3．检测步骤

(1)标定值的设置使用真菌毒素通用标定标准物，如表4-8所示。

表4-8 标色值的设置

(2)检测准备

①标定荧光计：确认延时时间为5min; 1倍0.1％吐温～20/PBS缓冲液(每月配制一次)；

②提取液：乙腈：水(90：10，体积比)，或者甲醇：水(80 : 20，体积)。

③试剂空白试验：1 mL甲醇+1mL显色剂置于测试管中，荧光计读数应为0。

④空白试验：2mL纯水置于测试管中，荧光计读数应为0。

(3)样品提取与稀释称取20g磨细的样品，2g氯化钠，置于搅拌杯中；加入50mL、甲醇：水(80: 20)溶液，或者乙腈：水(90 :10)；盖上搅拌杯的盖子，高速搅拌2min；取下盖子，将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于干净的容器中。

吸取10 mL滤液，置于干净的容器中，用40mL 1倍0.1％吐温-20/PBS缓冲液稀释，混匀；稀释液通过玻璃微纤维滤纸(1.0um)过滤，滤液收集于玻璃注射器中。

(4)色谱柱操作与测定

①取10 mL滤液以1～2滴/s的流速全部通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。

②取10 mL 0.1％吐温-20/PBS缓冲液以1～2滴/s的流速通过亲和柱。

③取10 mL纯水以1～2滴/s的流速通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。

④用1.0mL甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液(1mL)收集于玻璃测试管中。

⑤将1.0mL ZearalaTest显色剂加到测试管的淋洗液中。混匀后，将测试管置于已标定好的荧光计中。5min后，读数。

4．注意事项

(1)此方法的检测限为0.1mg/kg，测定范围0～5.0mg/kg。

(2)当测定浓度在5.0mg/kg以上时，应加以稀释。

(二)免疫亲和层析净化-高效液相色谱法

1．检测原理

用提取液提取样品中的ZEN，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。本方法(GB/T 23504-2009)适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮含量的测定，检出限：粮食等为20ug/kg,酱油醋等为50ug/kg。

2．试剂和仪器

(1)试剂甲醇、乙腈为色谱纯，其他为分析纯。

提取液：乙腈+水(9+1)。PBS清洗缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用990mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，再用水定容至1L。

ZEN标准储备液：准确称取一定量的ZEN标准品(纯度≥98%)，用甲醇＋乙腈(1+1)溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在-20℃保存，可使用3个月。ZEN标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的ZEN储备液，用流动相稀释，分别配成相当于10。50、100、200、500ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。

(2)仪器与设备ZEN免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸(直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性)，均质器(转速大于10000r/min)，高速万能粉碎机(转速10000r/min )，试验筛(1mm孔径)，高效液相色谱仪(配有荧光检测器)。

3．检测步骤

(1)样品制备与提取

①粮食和粮食制品：将样品研磨(硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛)。称取50.00g磨碎的试样于100 mL容量瓶中，加入5g氯化钠，用提取液定容，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。

②酒类：取脱气酒类样品(含CO₂的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含CO₂的酒类试样20.00g左右于50mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。

③酱油、醋、酱及酱制品：取25.00g左右混匀的试样，用乙腈定容至100.0mL，超声提取2min，定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。

(2)提取将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A或B或C 10.0mL，注入玻璃注射器中：将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。依次用10mL PBS清洗缓冲液(pH 4.4)和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。

准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1.0 mL, HPLC测定。

(3)测定

①高效液相色谱参考条件：色谱柱：C₁₈ 柱，5um, 150mm×4.6 mm；流动相：乙腈＋水＋甲醇(46+46+8)；流速：1.0mumin；柱温：35℃；进样量：20～100uL；检测波长：激发波长274 nm，发射波长440nm。

②定量测定：以ZEN标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量。

4.结果计算

试样中ZEN的含量按下式计算：

式中X—试样中ZEN的含量，ug/kg;

ρ₁—试样溶液中ZEN的浓度，ng/mL ;

ρ₀—空白试样溶液中ZEN的浓度，ng/mL;

V—甲醇洗脱液体积，mL;

m—试样的质量，g；

f—稀释倍数。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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