β-内酰胺类抗生素是在牛乳生产中应用最广泛的抗生素，用于治疗牛乳腺炎和其他细菌感染性疾病。按照国家规定，使用抗生素药物后一定时间内的乳汁，不得作为供人食用的原料。同时国家在《生鲜牛乳收购标准》中规定，生鲜乳中不得检出抗生素。然而就中国奶牛饲养环境而言，牛乳的绝对“无抗”较难达到，针对这种情况，市场上出现了“抗生素分解剂”，该分解剂可选择性分解牛乳中残留的β-内酰胺抗生素，其成分就是β-内酰胺酶(金玉兰酶制剂)。

β-内酰胺酶添加到乳与乳制品中能起到掩蔽抗生素的作用，但是由于该制剂的安全性风险未知，因此所有乳制品生产企业严禁在产品中添加此类物质。

(一)实验原理

该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。

(二)试剂与仪器

1.试剂

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682中规定的三级水。

①试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcus luteus) CMCC (B) 28001，传代次数不得超过14次。

②磷酸盐缓冲溶液。

③生理盐水(8.5g/L)。

④青霉素标准溶液。

⑤β-内酰胺酶标准溶液。

⑥舒巴坦标准溶液。

⑦营养琼脂培养基。

⑧抗生素检测用培养基II。

2．仪器

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：抑菌圈测量仪或测量尺；恒温培养箱：(36±1)℃；高压灭菌器；无菌培养皿：内径90 mm；底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖；无菌牛津杯：外径(8.0±10.1) mm，内径(6.0±0.1)mm，高度(10.0±0.1) mm；麦氏比浊仪或标准比浊管；pH计；无菌吸管：1mL (0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)；加样器：5～20 uL, 20～200uL及配套吸头。

(三)操作步骤

1．菌悬液制备

将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经(36±1)℃培养18～24h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×10¹⁰CFU/mL, 4℃保存，贮存期限2周。

2．样品制备

将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为A、B、C、D，每个样品做三个平行，共12管，同时每次检验应取纯水1mL加入到1.5mL离心管中作为对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节pH至6～7。

3．检验用平板制备

取90 mm灭菌玻璃培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ，凝固后上层加入 5mL含有浓度为1×10⁸ CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基Ⅱ，凝固后备用。

4．样品测定

按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及纯水中：

(A)青霉素5 uL ;

(B)舒巴坦25 uL、青霉素5 uL ;

(C)β-内酰胺酶25uL、青霉素G5 uL ;

(D)β-内酰胺酶25 uL、舒巴坦25 uL、青霉素5 uL。

混匀后，将上述(A)～(D)试样各200 uL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，(36±1)℃培养18～22h，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。

5．结果报告

纯水样品结果应为：(A)、(B)、(D)均应产生抑菌圈；(A)的抑菌圈与(B)的抑菌圈相比，差异在3mm以内(含3mm)，且重复性良好；(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定。

如果样品结果中(B)和(D)均产生抑菌圈，且(C)与(D)抑菌圈，差异在3mm以上(含3mm)时，可按以下判定结果。

(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈，差异在3mm以上(含3mm)，且重复性良好，应判定该试样添加有β-内酰胺酶，报告β-内酰胺酶类药物检验结果阳性。

(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差异小于3mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β-内酰胺酶，报告β-内酰胺酶类药物检验结果阴性。

如果(A)和(B)均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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