13.1.2.1荧光分子的特征光谱

荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及两种辐射，即激发光和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。

(1)激发光谱

荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的人射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波长，并记录相应的荧光强度，那么所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下所测量的荧光强度与激发光波长之间的关系，为荧光分析选择最佳激发波长提供依据。

(2)发射光谱

发射光谱又称为荧光光谱。通过固定激发波长，扫描发射波长所获得的荧光强度对发射波长的关系曲线为荧光发射光谱。发射光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对发射强度。荧光发射光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为荧光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。

荧光仪上所测绘荧光的激发光谱和发射光谱均属于表观光谱，当对仪器的光源、单色器和检测器等的光谱特征进行校准后，才能绘得校准的荧光的激发光谱和发射光谱。

(3)同步荧光光谱

荧光物质既具有发射光谱又具有激发光谱，如果采用同步扫描技术，同时记录所获得的谱图，称为同步荧光光谱，如图13-1所示。

图13-1 并四苯的特征光谱
(a)激发光潜和发射光谱; (b)同步荧光光谱，△λ=3nm

同步扫描可采取三种方式进行：第一，固定波长差同步扫描法。扫描时保持激发波长和发射波长的波长差固定；第二，固定能量差同步扫描法。扫描时激发波长和发射波长之间保持一个恒定的波数差；第三，可变波长同步扫描法。使两个单色器分别以不同速率进行扫描，即扫描过程中激发波长和发射波长的波长差是不固定的。

同步荧光光谱并不是荧光物质的激发光谱与发射光谱的简单叠加，同步扫描至激发光谱与发射光谱重叠波长处，才同时产生信号，如图13-1所示。在固定波长差同步扫描法中，△λ的选择直接影响到所得到的同步光谱的形状、带宽和信号强度。通过控制△λ值，可为混合物分析提供一种途径。例如，酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱很相似，发射光谱重叠严重，但△λ<15 m时的同步荧光光谱只显示酪氨酸的光谱特征，△λ＞60 m时，只显示色氨酸的光谱特征，从而可实现分别测定。

同步荧光光谱的谱图简单，谱带窄，减小了谱图重叠现象和散射光的影响，提高了分析测定的选择性。同步荧光光谱损失了其他光谱带，提供的信息量减少。

(4)三维荧光光谱

以荧光强度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图为三维荧光光谱，也称为总发光光谱，等高线光谱等。

三维荧光光谱可用两种图形表示，即三维曲线光谱图和平面显示的等强度线光谱图，如图13-2所示。从三维荧光光谱可以清楚看到激发波长与发射波长变化时荧光强度的信息。它能提供更完整的光谱信息，可作为光谱指纹技术用于环境检测和法庭试样的判证。

图13-2 三维荧光光谱图

(a)蒽和萘的二维荧光光谱图；(b)8-羟基苯芘的等强度线光谱图

13.1.2.2激发光谱与发射光谱的特征

(1)斯托克斯位移

在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，斯托克斯在1852年首次观察到这种波长位移的现象，因而称为斯托克斯位移。斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。激发态分子在发射荧光之前，很快经历了振动松弛或内转化过程而损失部分激发能，致使发射相对于激发有一定的能量损失，这是产生斯托克斯位移的主要原因。其次，辐射跃迁可能只使激发态分子衰变到基态的不同振动能级，然后通过振动松弛进一步损失振动能量，这也导致了斯托克斯位移。此外，溶剂效应以及激发态分子所发生的反应，也将进一步加大斯托克斯位移现象。

(2)镜像对称规则

分子的荧光发射光谱与其吸收光谱之间存在着镜像关系。如图13-3所示是苝在苯溶液的吸收和荧光发射光谱图。由图看出吸收和发射间存在较好的镜像关系。但是大多数化合物虽然存在这样的镜像关系，不过其对称程度不像苝这样好。镜像对称规则的产生是由于大多吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构类似，因此吸收光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。

(3)发射光谱的形状通常与激发波长无关

虽然分子的吸收光谱可能含有几个吸收带，但其发射光谱却通常只含有一个发射带。绝大多数情况下即使分子被激发到S₂电子态以上的不同振动能级，然而由于内转化和振动松弛的速率是非常快，以致很快地丧失多余的能量而衰变到S₁态的最低振动能级，然后发射荧光，因而其发射光谱通常只含有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关，只与基态中振动能级的分布情况以及各振动带的跃迁概率有关。

图13-3 苝在苯溶液中的吸收和发射光谱图

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文章来源：《分析化学分析方法的原理及应用研究》

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