7 测定步骤

7.1 样品处理

7.1.1 水解

称取5g试样(精确至0.01g)于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙酸钠缓冲溶液(4.10)和0.025 mL β-葡萄糖苷酸-硫酸酯复合酶(4.13)，旋涡混匀，于37℃水浴中振荡12 h。

7.1.2 提取

水解后加入15 mL无水乙醚，振荡提取5 min后，以4000r/min离心2 min，将上清液转移至浓缩瓶中，再用15 mL无水乙醚重复提取一次，合并上清液，40℃以下旋转浓缩至近干。残留物加1.0 mL三氯甲烷溶解后，转入10 mL离心管中，再用3 mL氢氧化钠溶液(4.9)润洗浓缩瓶后转移至同一离心管中，旋涡混匀，以4000 r/min离心2 min，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3 mL氢氧化钠溶液(4.9)重复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠溶液，加入1 mL磷酸溶液(4.11)，混匀后待净化。

7.1.3 净化

将样品提取液(7.1.2)转入HLB固相萃取柱(4.18)。用5 mL水、5 mL甲醇-水溶液(4.12)淋洗，弃去；再用10 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2 mL/min。洗脱液在40℃以下用氮气吹干。残留物用1.0 mL乙腈溶解，旋涡混匀后，过0.2 um滤膜，供仪器测定用。

7.2 测定条件

7.2.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：C₁₈,2 um, 50 mm×2.0 mm(内径)或相当者；

b)柱温：40℃；

c)流速：0.2 mL/min;

d)进样量：5 uL;

e)流动相及梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件

7.2.2 质谱参考条件

a)电离方式：电喷雾电离(ESI) ;

b)离子源喷雾电压(IS): 3500V;

c)离子源温度(TEM) : 350℃；

d)喷雾气流量：11L/min;

e)扫描方式：负离子扫描；

f)检测方式：多反应监测(MRM)，监测条件见表2。

表2 多反应监测条件

7.2.3 液相色谱-串联质谱测定

7.2.3.1 定性测定

每种被测组分选择一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质混合标准工作溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5％之内；且样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.2.3.2 定里测定

在仪器最佳工作条件下，用基质混合标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以基质混合标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

7.3 平行试验

按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。

7.4 空白试验

除不称取样品外．均按上述步骤进行。

8 结果计算

β-玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量的测定按式(1)计算：

式中：

x—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg) ;

c—从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

m—样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

计算结果应扣除空白值。

9 精密度

9.1 一般规定

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.2 重复性

在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中β-玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮的添加浓度范围及重复性方程见表4。

表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程

如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.3 再现性

在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中β-玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮的添加浓度范围及再现性方程见表4。

相关链接：动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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