5.2.2.5 四环素抗性的鉴定

5.2.2.5.1 接种

用移液器各吸取5uL～10uL 0.8%的四环素溶液和0.8%的氨苄青霉素溶液,在营养肉汤琼脂培养基平板表面沿中线涂成一条带,待四环素和氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌株菌液与四环素和氨苄青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株(作四环素抗性的对照)，37℃培养24h。

5.2.2.5.2 结果判定

TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区,表明TA102菌株有抗四环素效应。

5.2.2.6 uvrB修复缺陷型的鉴定

5.2.2.6.1 接种

在营养肉汤琼脂培养基平板表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平板一半用墨纸覆盖,在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s,37℃培养24h。

5.2.2.6.2 结果判定

对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TA100)仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。

5.2.2.7 生物素缺陷型(bio)的鉴定

5.2.2.7.1 底层培养皿的制备

加热融化底层培养基两瓶。一瓶加生物素,每100mL底层培养基中加0.5mmol D-生物素0.6mL和L-组氨酸1mL；另一瓶不加生物素，每100mL底层培养基中加L-组氨酸1mL,冷却至50℃左右,每种底层培养基各倒两个平板。

5.2.2.7.2 接种

取有生物素和无生物素培养基平板各一个,按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表面，37℃培养48h。

5.2.2.7.3 结果判定

株菌在有生物素培养基平板表面各长出一条菌膜,在无生物素培养基平板上除自发回变菌落外无菌膜,说明受试菌株确为生物素缺陷型。

5.2.2.8 自发回变率的测定

5.2.2.测定方法

准备底层培养基平板8个。融化顶层培养基8管,每管2mL,在45℃水浴中保温。在每管顶层培养基中,分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL,一式两份，轻轻摇匀，迅速将此试管内容物倒入已固化的底层培养基平板中，转动平板,使顶层培养基均匀分布,平放固化,37℃培养48h,计数菌落数。

5.2.2.8.2 结果判定

每一株的自发回变率应落在正常范围内。

5.3 菌株的保存

鉴定合格的菌株应保存在深低温(如-80℃),或加入9%光谱级DMSO作为冷冻保护剂保存在液氮条件下(-196℃)。无上述条件者可冰冻干燥制成干粉,4℃保存。除液氮条件外,保存期一般不超过2年。主平板贮存于4℃,超过2个月后应丢弃(TA102除外,保存2周后丢弃)。

6 试验设计及受试物的处理

6.1 溶媒

溶媒应不与受试物发生反应,对所选菌株和S9没有毒性,没有诱变性。首选蒸馏水,对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒,首选DMSO(每平板最高添加量不超过0.1mL)。也可选择其他溶媒。

6.2 剂量设计

决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。进行预试验有助于了解受试物对菌株的毒性和受试物的溶解度。对于无细菌毒性的可溶性受试物推荐的最高剂量是5mg/皿或5uL/皿;对于溶解度差的受试物,可以采用悬浊液,但溶液浑浊的程度(沉淀的多少)不能影响菌落计数。由于溶解度或者毒性的限制最大剂量达不到5mg/皿或5uL/皿时,最高剂量应为出现沉淀或细菌毒性的剂量。评价含有潜在致突变杂质的受试物时,试验剂量可以高于5mg/皿或5uL/皿。对于需要前处理的受试物(如液体饮料、袋泡茶、口服液和辅料含量较大的样品等)，其剂量设计应以处理后的样品计。

每种受试物在允许的最高剂量下设4个剂量组,包括加和不加S9两种情况。按等比组距的原则设定剂量间隔,推荐采用-组距。每个剂量应作3个平板。

一般受试物的最低剂量不低于0.2ug/皿。

受试物应无菌,必要时以适当的方法灭菌或除菌。

相关链接：细菌回复变试验（四）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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