3. PCR扩增植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其基原物种扩增COI序列，通用引物及扩增条件如下，特殊规定见各药材项下。

ITS2序列扩增正向引物ITS2F5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'；

反向引物ITS3R5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。

psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；

反向引物trnHR5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。

COI序列扩增正向引物HCO21985'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；反向引物LCO14905'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'。

PCR反应体系以25ul为参照，包括1×PCR缓冲液(不含MgCl，)，2.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/LdNTPs，0.1umol/L引物对，模板DNA，1.0U TaqDNA聚合酶，加灭菌双蒸水至25ul。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。

ITS2序列扩增程序94℃ 5分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 45秒，35～40个循环；72℃ 10分钟。psbAtrnH序列扩增程序94℃ 5分钟；94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，30个循环；72℃ 7分钟。COI序列扩增程序94℃ 1分钟；94℃ 1分钟，45℃ 1.5分钟，72℃ 1.5分钟，5个循环；94℃ 1分钟，50℃ 1.5分钟，72℃ 1分钟，35个循环；72℃ 5分钟。

4. PCR产物检测采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置(具体见各药材项下)出现一条目的条带，阴性对照应无条带。

5. 测序切取目的条带所在位置的在紫外灯下迅速凝胶，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。有目的条带的样品在测序仪上进行双向测序。

6. 中药材DNA条形码序列获得

(1) 序列拼接：对双向测序峰图应用有序列拼接功能的专业软件进行序列拼接，去除引物区。

(2) 序列质量与方向：为确保DNA条形码序列的可靠性，需去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致，获得相应的DNA序列。

7. 结果判定将获得的序列与国家药品管理部门认可的中药材DNA条形码标准序列比对。

三、方法学验证

应符合2015年版《中国药典》四部“中药质量标准分析方法验证指导原则”(通则9101)相关要求。

1. 影响因素考察考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取(样品量、水浴温度和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)和产物纯化(考察不同纯化试剂盒)，保证实验方法的准确性。

2. 方法适用性考察采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。

3. 基原物种对比验证以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DNA条形码数据，与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果准确性：

四、注意事项

(1) 实验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。

(2) 本法暂不适用于混合物与炮制品的鉴定及硫磺熏蒸等造成不适用的情况。

(3) 为防止外源微生物污染，实验前须将实验用具进行高压灭菌，并用75%乙醇擦拭药材表面。有些药材本身含有内生真菌，如果内生真菌存在于药材的外围组织，则选用内部组织进行实验。如果真菌遍布整个药材，植物类药材需选用psbA-trnH条形码(真菌内不含有该基因片段)，不能选用ITS2序列。为进一步确保实验结果不被真菌污染，实验者可在GenBank数据库应用BLAST方法对所获ITS2序列进行检验，以确保序列鉴定准确。

(4) 本法用于鉴定药材的基原物种，不能确定药用部位。

(5) 必要时结合其他鉴别方法综合判断。

(6) 种内阈值的确定。同一物种的不同样品间存在一定的变异范围，即种内变异阈值。不同物种，不同条形码序列均会影响种内变异范围。各基原物种的种内变异范围(种内遗传距离阈值)应在药材品种项下具体明确。

相关链接：中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则（一）

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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