一、蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝法(Bradford法)

1．速测原理

考马斯亮蓝法(Bradford法)根据蛋白质与染料相结合的原理设计。考马斯亮蓝G250(Coomassie G250)是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料。考马斯亮蓝G250能与蛋白质通过范德华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物青蓝色溶液，在595nm处有最大吸收值，复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。

Bradford法灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右；测定快速、简便，只需加1种试剂。完成一个样品的测定，只需5 min左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2min即可完成，其颜色可以在1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色稳定性好。这种蛋白质测定法具有突出优点，正在得到广泛应用。

2．速测范围

利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。

3．试剂与材料

(1)标准蛋白质溶液。用球蛋白G或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。

(2)考马斯亮蓝G-250染料试剂。称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95％的乙醇后，再加入120mL 85％的磷酸，用水稀释至1L。

(3)器材：可见光分光光度计，旋涡混合器，试管16支。

4．速测步骤

1)标准方法

(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按顺序分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.040、0.06、0.08、0.1mL，然后用无离子水补充到0.1mL。最后各试管中分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。

(2)加完试剂2～5 min后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A₅₉₅，空白对照为第一号试管，即0.1mL H₂O加5.0mL G-250试剂。

注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95％的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

(3)用标准蛋白质量(mg)为横坐标，用吸光度值A₅₉₅为纵坐标，做图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A₅₉₅值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白／mL溶液的A₅₉₅约为0.50。

2)微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时(10～100mg/mL)，可将取样量(包括补加的水)加大到0.5mL或1.0mL，空白对照则分别为0.5mL或1.0mL H₂O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0mL，同时做相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。

0.05mg牛血清蛋白／mL溶液的A₅₉₅约为0.29。

二、蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝速测管法

1．速测原理

考马斯亮蓝试剂在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，其颜色深度与蛋白质含量成正比。检测范围：液体样品为0.5～20g/100g，固体样品为1～40g/100g。

2．速测范围

本方法适用于乳粉、牛乳、豆乳等乳制品中蛋白质含量的快速检测。

3．速测步骤

(1)取乳粉2g(液体乳取4mL)于容器中，加纯净水或蒸馏水至100mL，充分摇匀；从中取1mL至另一容器中，加纯净水或蒸馏水至40mL，充分混匀成样品待测液。

(2)取一支蛋白质检测管，加入0.5mL样品待测液，加盖摇匀，反应2min后观察颜色变化，根据标准比色板进行半定量判定；每批检测需做一个纯净水或蒸馏水空白对照以便判断。

4．说明

(1)检测时各样品的提取时间、反应时间及操作方法尽可能保持平行一致。检测时若产生沉淀，提示蛋白质含量可能较高，应稀释后再测定。

(2)若样品有结块或难以溶解的现象，需对样品液加热或直接以热水稀释样品，以使样品充分溶解。

(3)当样品中蛋白质含量(应是三次测试结果的平均值)低于产品包装标示含量或国家标准规定含量时，应送实验室进一步确认。

5．试剂质量控制

定期与国标法检测进行比对，所得结果应在±20％以内。

相关链接：蛋白质的速测技术—双缩脲分光光度比色法(Biuret法)和双缩脲试剂盒法

文章来源：《食品安全快速检测技术》

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