8 检验程序

辐照食品微生物学筛选法检验程序见图1。

图1 辐照食品微生物学筛选法检验程序

9 检验步骤

9.1 制样

无菌条件下于样品的不同部位取样，共取10 g样品于已灭菌的塑料容器中，用一次性针筒加90 mL注射用无热源生理盐水，以8000r/min均质1 min～2 min，制成10-1样品稀释液，于4℃下保存备用，最长保存时间不超过24 h。

9.2 革兰氏阴性菌培养计数

9.2.1 培养基制备

制备缓冲蛋白陈水、营养琼脂培养基、革兰氏阴性菌选择性培养基，倾注平板前将融化的培养基于45℃±1℃水浴保温

9.2.2 接种和培养

9.2.2.1 根据样品污染情况，对样品稀释液(10^-1)作进一步的稀释，用缓冲收蛋白陈水对样品稀释液按照9 mL比1mL的体积比进行10倍梯度稀释，得到10^-2～10^-5样品稀释液。

9.2.2.2 把保持在45℃±1℃的营养琼脂培养基约10 mL倾入培养皿中，水平放置，待琼脂冷却凝固，加入0.1 mL的不同稀释度的稀释液涂布后于20℃～25℃下静置90 min。每个稀释度做两个平板。

9.2.2.3 每个平板覆盖10 mL革兰氏阴性菌选择性培养基，使样液与培养基充分混合。水平放置，使琼脂凝固。倒置平板于21℃±1℃培养箱中培养48h±1h。

9.2.2.4 选择菌落数为15～300的2个连续稀释度平板计数(见表1中例1)。按式(1)计算每克样品中的革兰氏阴性菌数N(CFU/g)：

式中：

N—每克样品中革兰氏阴性菌数，CFU/g;

∑_c—长有15～300菌落的2个连续稀释度平板的菌落之和；

V—每个平板接种的菌液体积，单位为毫升(mL) ;

n₁—第一个稀释度的计数平板数；

n₂—第二个稀释度的计数平板数；

d—计数有效平板的第一个稀释度。

若只有一个稀释度的平板长有15～300个菌落时，则n2计为0(见表1中例2)。

若所有稀释度的平板菌落数均小于15时，则以菌落数最多的平板的菌落数作为N值的估计值(见表1中例3)。

若所有稀释度的平板菌落均未长菌时，结果表示为未检测到革兰氏阴性菌，N值计为0(见表1中例4)。

表1 革兰氏阴性菌菌落数计算示例

9.3 内毒素检测

9.3.1 原理

在适宜条件下，细菌内毒素可激活宣试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据内毒素的含量测定革兰氏阴性菌的污染程度。

9.3.2 样品稀释

取300uL样品稀释液，加入装有650uL无热源生理盐水的1.5 mL已高温高压灭菌的微量离心管中，稀释倍数为10^-0.5，按照相同的体积比，将样品稀释液作进一步梯度稀释，稀释倍数视样品情况而定，要求最后一个稀释倍数的样品内毒素检测为阴性。

9.3.3 内毒素标准品溶解与稀释

取一管内毒素标准品，加入1 mL无热源生理盐水溶解为50 EU/mL的内毒素标准品溶液，同9.3.2 样品稀释法进行不同倍数稀释。

9.3.4 堂试剂溶解与分装

按试剂标示量，加入无热源生理盐水溶解，混匀，注意不要引起气泡，以每支0.1 mL分装于安瓶瓶内。

9.3.5 鲎试剂检测

以内毒素标准品溶液作为阳性对照，无热源生理盐水作为阴性对照，取0.1 mL稀释样品与分装的0.1mL、鲎试剂混匀，用石蜡封口膜封口，于37℃±1℃的水浴锅中静止放置60 min±2 min，当试剂发生完全凝集时记为“＋”。部分凝集时记为“＋/一”‘未凝集时记为“一”。

9.3.6 内毒素定量

根据不同稀释倍数内毒素标准品溶液的检测情况确定检测宣试剂的灵敏度。以发生凝固的最后一个样品稀释溶液的滴度用于计算，如果完全凝固时，以实际滴度用于计算(见表2中例1)，如果为部分凝固“+/-”时，则以该倍数的指数减去0.25后作为滴度值用于计算(见表2中例2)。按式(2)计算每克样品中内毒素含量LAL(EU/g)：

式中：

LAL－每克样品中内毒素含量，EU/g;

c－标准品中内毒素含量，EU/mL;

t－样品的滴度值：

T－标准品的稀释倍数。

表2 内毒素滴度计算示例

9.4 结果报告

9.4.1 计算1og₁₀ LAL、log₁₀ N和log₁₀AL-log₁₀ N值。

9.4.2 当样品经检测含有较高的内毒素含量，但经培养的革兰氏阴性菌数目较少或者未检测出有可培养的革兰氏阴性菌，即经计算log₁₀ LAL-log₁₀ N值大于0，报告为该样品可能经过辐照处理。

9.4.3 若样品经检测含有较高的内毒素含量，经培养的革兰氏阴性菌数目较多，经计算log₁₀ LAL-log₁₀ N值小于或等于0，报告为该样品未经过辐照处理。

9.4.4 当样品中内毒素含量较低(log₁₀ LAL＜2)并且经培养的革兰氏阴性菌数目较少(log₁₀ N<2)，报告为本方法不适用。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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